Estudio del metabolismo de inosin 5- monofosfato como precursor para la biosíntesis de riboflavina en ashbya gossypii

Resumen

La riboflavina es una vitamina esencial en humanos, implicada en multitud de procesos redox en la célula. Para mejorar la producción de esta vitamina, se ha estudiado la ruta biosintética de purinas en el organismo superproductor Ashbya gossypii para incrementar la disponibilidad del precursor GTP. En este trabajo hemos estudiado dos actividades del metabolismo del IMP: IMP deshidrogenasa e IMP nucleotidasa. El objetivo de nuestro trabajo con la enzima IMP deshidrogenasa codificada por el gen AgGUA1, fue la caracterización del centro de inhibición por GMP. La purificación, cristalización y resolución de la estructura de esta enzima en presencia de GMP, nos permitió identificar los aminoácidos que intervienen en la interacción proteína-inhibidor, y establecer el mecanismo de inhibición. Se realizaron 22 mutaciones por mutagénesis dirigida, para el análisis mutacional de este centro de inhibición, y se comprobó su resistencia a inhibición. También fue llevada a cabo la identificación del ORF codificante para la enzima IMP nucleotidasa tanto en S. cerevisiae como en A. gossypii. Esta identificación se realizo mediante la purificación de la proteína con FPLC y posterior análisis por espectroscopia de masas. El patrón de expresión de este gen muestra como existe un fuerte incremento de esta expresión en condiciones de estrés oxidativo. Por esto comprobamos el efecto del H2O2 sobre el crecimiento y la concentración intracelular de nucleótidos en la cepa isn1. El tratamiento con H2O2 provoca la acumulación de IMP y retrasa el crecimiento de la cepa isn1 mientras que en la cepa silvestre se observa un incremento de inosina. En ausencia del agente oxidativo, la cepa isn1 muestra bajos niveles de inosina e hipoxantina intracelulares, aunque no hay diferencias significativas en el crecimiento.