Purificacion y caracterizacion de una fosfatasa acida reprimible de yarrowia lipolytica. Estudio del procesamiento y aislamiento de una secuencia genica

Resumen

Se ha purificado una fosfatasa acida exocelular de yarrowia lipolytica que es reprimible por la concentracion de fosfato inorganico presente en el medio, pudiendo alcanzar valores en medios con 10 mg-l de este, del orden de 65-100 veces los niveles de actividad basales detectados en los medios normales utilizados. Esta enzima es una glicoproteina con un 60% en peso de carbohidrato. Su heterogeneidad en peso molecular, estimado entre 90 y 200 kda sobre geles de poliacrilamida con sds, se debe a su componente oligosacaridico. Experimentos de desglicosilacion con endo h han permitido estimar un peso molecular para la parte proteica de la enzima de 60 kda y un numero de 16 cadenas oligosacaridicas componentes de la subunidad enzimatica. La composicion de aminoacidos indica que es una proteina rica en acido aspartico y-o asparragina, serina y treonina. Se ha comprobado que y. Lipolytica secreta al medio un numero elevado de proteinas. Mediante experimentos de pulso y caza e inmunoprecipitacion con anticuerpos obtenidos contra la parte proteica de la enzima se ha detectado en extractos celulares un precursor de esta de 80 kda, parcialmente glicosilado. Tambien se han detectado en extractos de celulas desreprimidas tratadas con tunicamicina dos polipeptidos de 54 y 52 kda correspondientes a la proteina enzimatica no glicosilada, probablemente con y sin su secuencia señal, y en sobrenadantes dos polipeptidos de 38 y 20 kda. Mediante escrutinio de una genoteca de y. Lipolytica en gt11 con anticuerpos antifosfatasa se han detectado 9 fagos positivos. Se han analizado 3 de ellos comprobandose que son identicos. El dna del inserto de estos fagos ha servido para aislar un fragmento de dna de y. Lipolytic de 6,2 kb. La interrupcion de la copia cromosomal correspondiente a la secuencia genica aislada ha permitido comprobar que esta no codifica para la enzima purificada en este trabajo. Dicha secuencia genica no presenta homologia c