Nuevos fármacos en hemopatía aguda malignaantagonistas del receptor NK-1 en leucemia aguda mieloblástica

Resumen

La leucemia mieloblástica aguda (LMA) es una enfermedad maligna heterogénea en la que se produce una proliferación clonal de progenitores mieloides de la MO que conduce a un fallo medular y la muerte por infecciones y/o hemorragias. A pesar de haberse alcanzado un progreso considerable en el diagnóstico y clasificación de la LMA en las últimas tres décadas, dos tercios de los adultos jóvenes y hasta el 90% de los mayores de 65 años fallecen a causa de su enfermedad. Los pilares del tratamiento actual de la LMA con agentes quimioterápicos mantienen combinaciones terapéuticas basadas en diseños de hace más de 30 años y con efectos tóxicos importantes. Es crucial el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que permitan mejorar la supervivencia a largo plazo de estos pacientes, especialmente para aquellos casos con enfermedad refractaria o recidivante en los que los tratamientos disponibles en la actualidad son insuficientes. La SP es un neuropéptido de la familia de las taquicininas que está ampliamente distribuida en la mayoría de órganos y tejidos y en las células progenitoras hematopoyéticas y en células maduras del sistema inmune. La SP en la MO es liberada como neurotransmisor por las fibras nerviosas peptidérgicas que inervan la MO, y por otro lado es liberada por las propias células que residen en la médula. A través de su receptor NK1R, la SP promueve la proliferación y maduración celular en distintas fases dentro de la hematopoyesis y actúa como un modulador positivo de la hematopoyesis induciendo citoquinas estimuladoras de la hematopoyesis. Parece ser que la SP se libera preferentemente cuando el sistema neuronal y no neuronal está fuertemente activado. Esta situación ocurre bajo circunstancias patológicas por lo que se piensa que los antagonistas de NK1R podrían hacer su efecto cuando el sistema SP-NK1R está regulado al alza y presenta una liberación incrementada de SP y/o una sobreexpresión de NK1R. Esto se ha descrito en procesos patológicos y enfermedades como la emesis, depresión, degeneración neuronal, enfermedad inflamatoria intestinal, así como en el cáncer. Una de las acciones del sistema SP/NK1R que ha tenido mayores implicaciones en la investigación ha sido su capacidad mitogénica, comprobada en diferentes tipos celulares sanos así como es distintas líneas celulares tumorales. En la última década, numerosos trabajos han puesto de manifiesto que tanto la SP como su receptor NK1R se expresan en diferentes tipos de células tumorales. En todas las líneas tumorales estudiadas la SP inducía proliferación celular y mitogénesis y además, con el bloqueo de los NK1R con diferentes antagonistas específicos de este receptor se ha comprobado un efecto antitumoral y muerte celular por apoptosis. Algunos estudios ya señalan un papel relevante del eje neuro-inmune-hematopoyético a través del sistema SP-NK1R en la regulación de la hematopoyesis. Alteraciones en el balance SP-NK1R con algunos moduladores negativos de la hematopoyesis como la NKA a través de NK2R, podría estar implicado en la fisiopatología de algunos procesos hematológicos como la LLA y la mielofibrosis. En este trabajo demostramos por primera vez que el bloqueo farmacológico con cuatro antagonistas NK1R (L-733,060, L-732,138, CP96-345 y Aprepitant) reduce la viabilidad de dos líneas celulares de LMA (KG-1 y HL-60) y produce muerte celular por apoptosis en estudios in vitro y presentamos datos preliminares de estudios in vivo con fosaprepitant que son alentadores. Por tanto, el receptor NK1R podría ser una nueva y prometedora diana terapéutica en el tratamiento de la LMA basándonos en nuestros resultados: 1) Las células de LMA sobreexpresan el receptor NK1R y en concreto la isoforma truncada. Estudiamos por Western Blot la expresión de NK1R en las líneas celulares de LMA tanto KG-1 como HL-60 y las comparamos con células mononucleares de médula ósea de donante sano. Se obtienen dos bandas correspondientes a dos isoformas de aproximadamente 60 y 50 Kda cada una. Por densitometría encontramos que la expresión de NK1R en KG-1 y HL-60 es 20 y 12 veces mayor que el control respectivamente. Mediante la RT-PCR cuantitativa detectamos que las líneas de LMA, tanto KG-1 como HL-60 expresan mRNA para el NK1R (gen TAC1R) con un ratio de 2.21 y 2.43 veces superior en comparación con linfocitos de sangre periférica. Diferenciando las dos isoformas del NK1R, no encontramos diferencias significativas en la expresión de la isoforma full-length del gen TAC1R, entre las células leucémicas (ratio de 1,01 veces para KG-1 y 0,945 veces para HL-60) y los linfocitos. Por el contrario, sí existen diferencias estadísticamente significativas entre las dos líneas celulares y los linfocitos para la expresión de TAC1R truncado con un aumento de la ratio de 3,78 y 4,81 veces para KG-1 y HL-60 respectivamente (p=0.016 y 0.009 respectivamente) 2) La SP induce la proliferación de células leucémicas de LMA. Demostramos un efecto proliferativo o mitogénico de la SP en ambas líneas de LMA (KG-1 y HL-60). El porcentaje de proliferación celular observado alcanza un máximo del 20.6% ± EEM 2,77 en la línea KG-1 y un 31.6% ± EEM 5,56 en la línea HL-60 con SP a 25 nM para la línea celular KG-1 (p=0.109) y 50 nM para la línea celular HL-60 (p=0.028) 3) Distintos antagonistas del receptor NK1R con composiciones químicas diferentes que comparten sólo su capacidad de bloquear NK1R producen la inhibición de células de LMA en estudios in vitro. Se comprueba una inhibición de la proliferación de ambas líneas celulares de LMA (KG-1 y HL-60) con concentraciones crecientes de cada uno de los cuatro antagonistas de NK1R estudiados: CP 96-345, aprepitant, L-733,060 y L-732,138. Mediante experimentos con MTS demostramos que se reduce progresivamente la viabilidad de las células tumorales de LMA a medida que aumentamos la concentración del antagonista NK1R hasta reducir casi por completo la viabilidad celular en comparación con las células de LMA no tratadas. Además demostramos que la muerte de estas células se produce por apoptosis mediante experimentos con Dapi. Mediante experimentos de inhibición competitiva, observamos que la acción mitogénica de la SP sobre las líneas de LMA es parcialmente revertida al bloquear NK1R y que la inhibición celular producida por los antagonistas NK1R es revertida de forma parcial con la administración exógena de dosis nanomolares de SP. Estos resultados indican que la estimulación mitogénica de la SP y el efecto antitumoral de los antagonistas sobre las líneas tumorales de LMA ocurren a través de NK1R 4) Estudiamos el efecto del antagonista NK1R aprepitant sobre linfocitos sanos para comprobar la citotoxicidad de este fármaco sobre células sanas hematopoyéticas y comprobamos que con concentraciones elevadas de aprepitant (60 ¿M) el porcentaje de viabilidad de linfocitos se mantiene en torno al 78% y comprobamos que el efecto proliferativo de la SP sobre linfocitos no se bloquea de forma significativa con el antagonista aprepitant como ocurría en ambas líneas de LMA. 5) Se comprueba el aumento de supervivencia en modelo de ratón xenoinjertado con células de LMA (HL-60) tratados con el antagonista NK1R fosaprepitant con inyecciones diarias intraperitoneales a dosis de 80 mg/kg/día de aprepitant. Aunque no se encuentran diferencias estadísticamnete siginificativas, los resultados son prometedores y requieren nuevos estudios in vivo con mayor número de ratones para corroborar el posible efecto antitumoral de fosaprepitant. Por todo ello, nuestros resultados identifican al receptor NK1R como una diana terapéutica prometedora en LMA y los antagonistas de NK1R como una nueva generación de fármacos para el tratamiento de la LMA.