Mecanismos reguladores del tráfico en la interfaz retículo endoplasmático/Golgi

Resumen

La ruta secretora permite el transporte de proteínas y lípidos (cargo) desde el Retículo Endoplasmático RE a la membrana plasmática, al exterior celular o a endosomas. El primer paso de la ruta secretora es la generación de vesículas con cubierta COPII que transportan el cargo hasta las cisternas del Golgi temprano, un proceso regulado por la GTPasa Sar1. La activación de Sar1 se produce por un factor intercambiador de nucleótido de guanina o GEF específico denominado Sec12, que hasta ahora no había sido identificado en ningún hongo filamentoso. Aspergillus nidulans es un hongo ascomiceto filamentoso con unas características que hacen de él un modelo muy adecuado para el estudio del tráfico intracelular. En el primer capítulo de esta tesis doctoral se presenta la caracterización del gen esencial AN11127 como Sec12. El análisis bioinformático de la proteína AN11127 identificó la presencia del motivo estructural conservado K-loop y de características topológicas propias de Sec12. El producto del gen AN11127, etiquetado con GFP, se localiza en el RE como es de esperar para la GEF de Sar1. El dominio citosólico de la proteína AN11127 es capaz de estimular el intercambio de GDP por GTP de forma específica sobre Sar1 en un ensayo in vitro con proteínas purificadas. La expresión forzada del gen AN11127 rescata parcialmente el defecto de crecimiento asociado al alelo termosensible sar1-6 a 37ºC, un indicio experimental de que la modulación del regulador Sec12 podría tener una aplicación biotecnológica en la mejora de la secreción de hongos industriales. Rab1 es una de las principales GTPasas implicadas en la regulación del tráfico en el aparato de Golgi. En un segundo capítulo, determinamos los mecanismos moleculares que subyacen a la supresión de la letalidad asociada a rab1delta por mutaciones en el gen uso1. El gen uso1 es esencial en A. nidulans y codifica una proteína con un dominio globular y un dominio coiled-coil, cuyos homólogos en mamíferos y en levadura son efectores de Rab1 y han sido relacionados con una función de tethering en el tráfico del RE al Golgi. Las mutaciones E6K y G540S en uso1, identificadas previamente en un screening de supresores extragénicos de la letalidad a 37ºC de un mutante termosensible de rab1, muestran aditividad en cuanto a su capacidad de rescatar la letalidad de rab1delta. Por lo tanto, la regulación de Uso1 es la función fundamental de Rab1. Mediante estudios de ultracentrifugación analítica determinamos que Uso1 es un homodímero y que se requiere del dominio coiled-coil para su dimerización. La localización intracelular de Uso1 en estructuras punteadas se encuentra subordinada a la GTPasa Rab1. Sin embargo, la presencia de las sustituciones E6K y G540S permite que Uso1 sea reclutada de forma independiente de Rab1. Ha de existir por tanto un anclaje de Uso1 alternativo a Rab1. Mediante estudios de copurificación con potenciales interactores de Uso1, identificamos la asociación de Uso1 a las SNAREs del complejo Sed5-Bos1-Bet1-Sec22, que regula la fusión de vesículas COPII con el Golgi. Comprobamos con ensayos con proteínas purificadas que las sustituciones E6K y G540S potencian la unión directa del dominio globular de Uso1 a la Qb SNARE Bos1, lo que constituiría un mecanismo de reclutamiento de Uso1 a membranas en ausencia de Rab1. En paralelo, demostramos que el dominio coiled-coil no es esencial a 30ºC para la función de Uso1 si el dominio globular presenta las sustituciones E6K y G540S, lo que refuerza la conclusión de que la función esencial de Uso1 recae en la actividad del dominio globular con las SNAREs y no en la función como tether, que es mediada por el dominio coiled-coil y que resulta dispensable. Finalmente, presentamos un modelo que combina los datos disponibles hasta ahora y las conclusiones alcanzadas en esta tesis doctoral para describir los mecanismos por los que Uso1 tendría un papel fundamental como regulador del ensamblaje del haz de SNAREs Sed5-Bos1-Bet1-Sec22.