Identification and characterization of nercc1/nek9-interactins proteins

  1. REGUÉ BARRUFET, LAURA
Dirigida por:
  1. Joan Roig Amorós Director/a
  2. Carme Caelles Franch Director/a

Universidad de defensa: Universitat de Barcelona

Fecha de defensa: 16 de junio de 2011

Tribunal:
  1. Pedro Marrero González Presidente/a
  2. David Reverter Cendrós Secretario/a
  3. María de la Paz Sacristán Martín Vocal

Tipo: Tesis

Teseo: 310729 DIALNET

Resumen

Les proteïnes quinases són elements centrals a la regulació dels processos que condueixen a la divisió i multiplicació de les cèl¿lules eucariotes. p34Cdc2/CDK1 col¿labora en l'execució d'aquesta fase del cicle cel¿lular amb altres quinases mitòtiques de les famílies Polo i Aurora, i NIMA (Nigg, E. 2001. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 21-32). La família NIMA (Neks en vertebrats) està formada per quinases evolutivament relacionades amb NIMA, un enzim del fong Aspergillus necessari per a entrar en mitosis independentment de l'estat d'activació de p34Cdc2 (O'Connell et al. 2003. Trends Cell. Biol. 13: 221-8). Onze membres diferents de la família NIMA (Neks) han estat descrits a mamífers, entre ells les tres proteïnes quinases objecte d'aquest projecte: Nek9, Nek6 i Nek7 (O'Connell, 2003). Les Neks comparteixen un domini quinasa N-terminal homòleg al de NIMA, seguit per una part C-terminal variable. Cap de les Neks caracteritzades fins al moment ha demostrat tenir l'impacte regulador en mitosis de NIMA a Aspergillus. El coneixement sobre la regulació i funció de les Nek suggereix que els seus membres tenen un paper important en relació al control dels centrosomes i microtúbuls i en el control de la maquinària de divisió cel¿lular. Amb la finalitat d'entendre millor la via de senyalització formada per Nek9/Nek6, en aquest treball: 1. Hem mapat la interacció del casset Nek9/Nek6 amb Plk1 (Bertran et al. EMBO J. en revisió), amb Nedd1, amb Cdc16 i amb Eg5 (Rapley et al. 2008. J. Cell Sci. 121:3912-21), mitjançant la tècnica del doble híbrid en llevat, aconseguint d'aquesta forma entendre millor el mecanisme d'activació del casset en mitosis, i la funció d'aquestes quinases en la formació del fus. 2. Hem identificat noves proteïnes que interaccionen amb Nek9 mitjançant la tècnica del doble híbrid en llevat, utilitzant diferents formes de Nek9 com a esquer assajant llibreries de cDNA humanes. L'estudi d'aquestes proteïnes ens ha permès confirmar la funció de Nek9 en la regulació del cicle cel¿lular, els microtúbuls i els centrosomes, així com proposar noves funcions de la quinasa en la resposta al dany al DNA o en la diferenciació cel¿lular. 3. Hem caracteritzat en cèl¿lules de mamífer la interacció de Nek9 amb el positiu de l'assaig del doble híbrid LC8, una subunitat del motor dineïna implicada en la dimerització i estabilització de les proteïnes amb què interacciona (Barbar 2008. Biochemistry 40:1596-605). Hem mapat la unió de LC8 al motiu 945KGTQT949 de Nek9, hem determinat el mecanismes de regulació d'aquesta unió per fosforilació del residu Ser944 de Nek9 durant la mitosis, i hem demostrat la funció d'aquesta unió en l'estructura quaternària de Nek9 i en l'activació de la quinasa. En condicions fisiològiques, hem demostrat que aquesta unió regula la interacció de Nek9 amb Nek6, per tant regulant la fosforilació i activació de Nek6 i l'activitat fisiològica d'aquesta quinasa durant la mitosis (Regué et al. 2011. J. Biol. Chem. in press) En conclusió, hem estudiat la funció i regulació del casset Nek9/Nek6, ampliant el coneixement de les bases moleculars de la regulació de l'activitat d'aquestes quinases i les vies de senyaltizació a través de les quals realitza les seves funcions.