CDK phospho-regulation of the Rad51-accessory factor Sfr1 and its role in meiotic recombination
- Cristina Martín Castellanos Director
Defence university: Universidad de Salamanca
Year of defence: 2024
- Enrique Martínez Pérez Chair
- Pedro Antonio San Segundo Nieto Secretary
- Tatiana García Muse Committee member
Type: Thesis
Abstract
La meiosis es una división especializada que asegura la transmisión fiel del genoma a una descendencia viable en organismos con reproducción sexual. En concreto, la meiosis es crucial para mantener la ploidía de las especies porque reduce el número de cromosomas a la mitad, produciendo cuatro gametos haploides a partir de una célula progenitora diploide (Bolcun-Filas & Handel, 2018; Zickler & Kleckner, 2023). Para ello, incluye una ronda de replicación del ADN seguida de dos rondas consecutivas de segregación cromosómica denominadas meiosis I (MI, segregación de homólogos) y meiosis II (MII, segregación de cromátidas hermanas). Además, esta división también es esencial para la evolución de las especies ya que genera variabilidad genética de dos maneras. En primer lugar, combinando los cromosomas maternos y paternos de diferentes maneras en los gametos y, en segundo lugar, intercambiando material genético entre los homólogos durante la recombinación meiótica, creando así nuevas combinaciones de alelos. Además de aumentar la heterogeneidad genética, la recombinación meiótica que ocurre durante profase cumple otra función crucial: garantiza la correcta disyunción de los homólogos en MI y, de este modo, asegura que los cromosomas se distribuyan correctamente en gametos viables. Los crossovers (COs) resultantes de la recombinación unen cada par de homólogos en el quiasma, y la tensión proporcionada por esta conexión favorece la correcta biorientación y segregación opuesta de los cromosomas homólogos en la MI. En ausencia de COs y quiasmas, es probable que los homólogos se orienten mal y segreguen ambos en la misma dirección produciendo gametos aneuploides que pueden ser inviables o dar lugar a una descendencia defectuosa (Petronczki et al., 2003; Székvölgyi & Nicolas, 2010). Mecanismo de recombinación meiótica en S. pombe: durante profase meiótica, la recombinación se inicia con roturas de doble cadena (DSBs) introducidas en el ADN por la endonucleasa Spo11 (Rec12 en S. pombe) de manera controlada y deliberada. Tras el procesamiento y resección de los extremos 5’, se generan tramos 3' de ADN de cadena sencilla donde las recombinasas Rad51 y Dmc1 se cargan ensamblando un nucleofilamento helicoidal que lleva a cabo la búsqueda e invasión de una secuencia homóloga adecuada para la reparación (Brown & Bishop, 2015). La invasión del molde da lugar a la estructura del D-loop (displacement loop), que puede implicar bien a una cromátida homóloga (interhomolog, IH) o a la hermana (intersister, IS) en función de la elección del molde. En este punto, el proceso de reparación puede tomar dos destinos. En primer lugar, el D-loop puede desestabilizarse o deshacerse por la acción de helicasas y la rotura se repara mediante Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA), esta vía produce exclusivamente non-crossovers(NCO) que pueden contener intercambios no recíprocos al copiar la secuencia del homólogo para la reparación (conversión 140 génica, GC) (Lorenz, 2017; Lorenz et al., 2014). En el otro destino, el D-loop se estabiliza generando intermediarios o joint molecules (JM) que maduran en la Holliday junction (HJ). En S. pombe, las HJs se resuelven por la endonucleasa selectiva de estructura (SSE) Mus81-Eme1 generando un NCO o un CO dependiendo de las hebras cortadas. Esta resolución está sesgada para asegurar suficientes COs dada su relevancia para la segregación. De hecho, la cantidad y distribución de COs está controlada en la mayoría de organismos por distintos mecanismos que regulan su distribución homogénea y aseguran que se forme al menos un CO entre cada par homólogo (Pazhayam et al., 2021; S. Wang et al., 2015; Zickler & Kleckner, 2016). A parte de la formación de COs, otro punto crítico de la meiosis es la resolución de JMs (joint molecules) o intermediarios ramificados de recombinación antes de MI. Si los intermediarios persisten más allá de profase, mantienen los cromosomas sin reparar y conectados erróneamente durante anafase I, lo cual impide su correcta segregación y, en última instancia, produce gametos aberrantes o inviables (Hunter, 2015; San-segundo & Clemente-blanco, 2020; Wyatt & West, 2014). Existen distintas proteínas que procesan y resuelven estas JMs, como SSEs y helicasas; además, estos sistemas suelen ser más relevantes en fases tardías de la meiosis y algunos están regulados temporalmente por mecanismos dependientes del ciclo celular (Alonso-Ramos et al., 2021; Gallo-Fernández et al., 2012; Grigaitis et al., 2020; Matos et al., 2011). Entre los sistemas implicados en la eliminación de la JM, algunas proteínas garantizan específicamente que los nucleofilamentos de la recombinasa se desmantelen tras la invasión productiva para permitir la progresión de la reparación, como es el caso en S. pombe de la F-box DNA helicasa Fbh1 junto con su cargador Dbl2 (Polakova et al., 2016; Sun et al., 2011). Actividad recombinasa y el factor auxiliar Swi5-Sfr1 Durante el proceso de recombinación, las recombinasas realizan un paso clave: la invasión del molde homólogo que permite la reparación fiel de la información genética. La mayoría de los eucariotas tienen dos recombinasas, Rad51 (también llamada Rhp51 en S. pombe) y Dmc1, que pertenecen a la familia bacteriana RecA. Rad51 y Dmc1 son esenciales para la meiosis en diferentes organismos. Su ausencia conduce generalmente a una reparación defectuosa de las DSBs, a segregaciones cromosómicas aberrantes e incluso al bloqueo del ciclo meiotico, lo que a menudo resulta en gametos inviables e infertilidad (Brown & Bishop, 2015). La actividad de Rad51 (y Dmc1) depende de su actividad ATPasa y de varias proteínas que modulan la dinámica de los nucleofilamentos. Estos factores pueden clasificarse en tres categorías: proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (SSBs, ssDNA binding proteins), factores auxiliares/accesorios de las recombinasas (RAFs) y helicasas/translocasas de ADN (Liu, Ehmsen et al., 2011). Específicamente, el segundo grupo (RAFs), incluye varias proteínas y complejos que contribuyen a la formación de nucleofilamentos y/o a su actividad catalítica de diferentes maneras. Entre ellos, el complejo Swi5-Sfr1 es uno de los RAF de Rad51 (y Dmc1) más relevantes. Está bien conservado a lo largo de la evolución, desde las levaduras hasta los humanos, y se ha estudiado molecularmente de forma exhaustiva en levaduras de fisión y otros organismos (Argunhan, Murayama & Iwasaki et al., 2017). Swi5- Sfr1 estimula la actividad recombinasa de Rad51 y Dmc1 mediante dos mecanismos. En primer lugar, gracias a su estructura alargada y curvada se inserta en el surco helicoidal estabilizando el nucleofilamento en su forma activa (unido a ATP) e impidiendo su disociación y, en segundo lugar, estimula la actividad ATPasa de Rad51 (y Dmc1) necesaria para la invasión del molde homólogo. Dada esta función de Swi5-Sfr1, su ausencia impide la recombinación homóloga en mitosis y en meiosis in vivo, afectando específicamente en meiosis a la invasión y recombinación con el cromosoma homólogo (Hyppa & Smith, 2010). Swi5-Sfr1 como posible sustrato de CDK en meiosis Las quinasas dependientes de ciclina (CDK) ordenan la progresión del ciclo celular en mitosis y en meiosis, y coordinan distintos procesos celulares con las distintas fases del ciclo. En meiosis, la actividad CDK está involucrada en eventos específicos como la arquitectura nuclear, la formación de DSBs, la recombinación y la sinapsis de los homólogos, aunque se conocen muy pocos sustratos involucrados (Palacios-Blanco & Martín-Castellanos, 2022). Las dianas reguladas por CDK en la reparación de daño y en el ADN han sido ampliamente documentadas en mitosis, pero no tanto en meiosis. Algunos de estos sustratos probablemente sean compartidos en ambos escenarios, mientras que otros serán exclusivos de eventos meióticos. Dado que evidencias previas del laboratorio sugerían que la actividad CDK participa de alguna forma en el procesamiento y reparación de DSB meióticos en S. pombe, buscamos posibles dianas de CDK en este proceso celular. Basándonos en que la secuencia de Sfr1 contiene 7 sitios consenso de fosforilación por CDK, en que algunos de estos sitios figuraban fosforilados in vivo en estudios fosfoproteómicos masivos en mitosis, y en la capacidad del RAF Swi5-Sfr1 para modular la recombinación, seleccionamos y estudiamos la proteína Sfr1 como candidata a ser fosforregulada por CDK.