Localización subcelular e interacciones moleculares de la proteína 2b del virus del mosaico del pepinosu relevancia en la función supresora de silenciamiento génico

Résumé

El silenciamiento génico es una importante resistencia de las plantas frente a los virus. Los virus han desarrollado proteínas con actividad supresora de silenciamiento que interfieren esta defensa uniendo RNAs pequeños (small RNAS, sRNAs) que dirigen el silenciamiento, interaccionando con proteínas de la maquinaria de silenciamiento, o de ambas formas. La proteína 2b del Virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) tiene función supresora y es un determinante de patogenicidad, y varios grupos han postulado que su actividad supresora requiere de su localización nuclear, su interacción con determinadas proteínas argonauta (AGO) o su unión a sRNAs. Este trabajo ha pretendido contribuir a determinar la importancia relativa de estas propiedades. Para ello utilizamos diversas aproximaciones experimentales: expresión transitoria mediante agroinfiltración de la proteína nativa o modificada fusionada a marcadores fluorescentes para visualizar in vivo su localización subcelular en células epidérmicas de Nicotiana benthamiana; estudios de colocalización con otras proteínas de la planta marcadas para fluorescer; y visualización in vivo interacciones proteína-proteína mediante complementación bimolecular fluorescente (bimolecular fluorescence complementation, BiFC). También evaluamos la actividad supresora de nuestras construcciones por una variante de la agroinfiltración, y comparamos sus actividades. Con ello caracterizamos el efecto de la fusión de marcadores fluorescentes en la actividad supresora de la proteína y nueve mutantes afectando a regiones relevantes de la proteína descritas por otros grupos, visualizamos sus localizaciones subcelulares, y por BiFC sus interacciones con proteínas; y por otro lado evaluamos sus capacidades de unir siRNAs in vitro. Los mutantes sin actividad supresora se acumularon pobremente en el tejido, aunque en presencia del supresor P19 de tombusvirus se restableció la acumulación, demostrando que su falta de actividad supresora se debía a las mutaciones. La proteína 2b fusionada a marcadores fluorescentes retuvo su actividad supresora y se localizó en citoplasma y núcleo. Y dentro de éste en nucléolo y cuerpos de cajal (cajal bodies, CBs), no descrito anteriormente. Las delecciones en las señales de localización nuclear inhibieron la entrada al núcleo mientras que la delección de un supuesto motivo de fosforilación la confinó en el nucléolo. La adición de una señal de exportación nuclear traslocó la proteína al citoplasma aunque no afectó a su actividad supresora, demostrando que para la misma la proteína no necesita acumularse en el núcleo. En BiFC, tanto la proteína 2b como los mutantes formaron homodímeros en citoplasma y nucléolo, e interaccionaron con las proteínas AGO1 en citoplasma y AGO4 en el núcleo excluyendo el nucléolo; y potencialmente con otras proteínas nucleares. En ensayos in vitro caracterizamos las uniones de las proteínas 2b y mutantes a sRNAs de 21 nucleótidos de doble hebra, hebra sencilla y un micro RNA. La proteína 2b unió sendos sRNAs a ratios molares 2:1, y un RNA largo con distintas afinidades, mientras que los mutantes sin actividad supresora apenas unieron sRNAs. Por lo tanto, aunque la proteína 2b de CMV se acumula en nucléolo y CBs, su actividad supresora no requiere dicha acumulación y parece realizarse por proteína citoplásmica. De los diferentes estudios encontramos una correlación entre la actividad supresora y la unión a sRNAs de doble hebra a ratios molares 2:1. Esto sugiere que los dímeros de proteína 2b interfieren con el silenciamiento antiviral secuestrando estos sRNAs de secuencia viral en el citoplasma, sin excluir otras posibles formas de actuación.