Búsqueda de perfiles moleculares diferenciales entre tolerancia y sensibilización en la respuesta alérgica

Resumen

Objetivo: La sensibilización y la tolerancia (natural o inducida) frente a alérgenos puede deberse a múltiples y diferentes mecanismos. El objetivo principal de este estudio es encontrar diferencias moleculares que indiquen la aparición o no de la enfermedad, en la respuesta al polen de olivo, con el fin de definir biomarcadores y/o posibles dianas terapéuticas, que nos ayuden a mejorar el diagnóstico, pronóstico y/o el tratamiento. Materiales y Métodos: Se seleccionaron 84 sujetos, clasificados clínicamente en 5 grupos: Grupo 1 (no alérgicos), Grupo 2 (asintomáticos, con anticuerpos IgE frente al polen de olivo), Grupo 3 (alérgicos, pero no al polen de olivo), Grupo 4 (alérgicos al polen de olivo, sin tratamiento) y Grupo 5 (alérgicos al polen de olivo tratados con inmunoterapia específica), de los que se obtuvieron suero y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) durante y fuera del periodo de polinización. En el suero, se determinaron los niveles de IgE total y de los anticuerpos IgE, IgA e IgG4 específicos al polen de olivo, así como de un perfil de citocinas Th1, Th2, Treg y Th17. A partir de las PBMCs, se extrajo el RNA y se analizó la expresión del gen FOXP3 mediante qRT-PCR. La presencia de células reguladoras fue analizada mediante microscopía confocal en PBMCs en suspensión (sin fijación). Por otro lado, se realizó un análisis masivo de expresión génica mediante microarrays, a partir de RNA obtenido de las PBMCs (durante y fuera del periodo de polinización) de 6 sujetos de cada grupo. Tras hacer análisis de calidad de los datos con programas específicos y obtener la expresión diferencial según las condiciones experimentales, se llevaron a cabo análisis funcionales con KEGG para rutas y con Gene-Ontology para los procesos biológicos, seleccionándose finalmente, 93 genes representativos y diferenciales que fueron validados por qRT-PCR. Resultados: Los mayores niveles de anticuerpos IgE específicos se observaron en los sujetos alérgicos al polen de olivo (con o sin inmunoterapia), los sujetos tratados con inmunoterapia mostraron los niveles más altos de anticuerpos IgG4 específicos y los sujetos asintomáticos, los mayores niveles de IgE total. El resultado más relevante del análisis de citocinas fue el descenso de los niveles de TGF-ß en los sujetos alérgicos al polen de olivo no tratados, durante la polinización. En este mismo grupo, se encontró un descenso en la expresión de FOXP3 y una menor cantidad de células reguladoras. Los resultados de expresión génica masiva mediante el Análisis de Componentes Principales (PCA), mostraron la buena clasificación clínica de los grupos, ya que, se obtuvieron 5 agrupamientos, que correlacionaban con los 5 grupos clínicos del estudio. Se encontraron genes y rutas diferenciales (relacionados o no con la respuesta inmuno-alérgica) entre los 5 grupos, siendo en general, mayores las diferencias entre los sujetos alérgicos y los controles (no alérgicos o asintomáticos). De los 93 genes validados por qRT-PCR, se confirmó que 35, además de mantener la significación, al ser analizados mediante un modelo jerárquico no supervisado, para clasificar las muestras según la expresión de estos genes, eran capaces de discriminar los distintos perfiles de respuesta al polen de olivo, con una buena sensibilidad y especificidad. Conclusiones: Los resultados de la respuesta humoral, junto al descenso de TGF-ß, FOXP3 y células reguladoras en los sujetos alérgicos al polen de olivo durante la polinización, sugieren un descenso de sus mecanismos reguladores, así como, una recuperación de estos, mediante la inmunoterapia específica. El estudio diferencial de expresión génica masiva y su posterior validación por qRT-PCR, ha permitido definir un perfil de expresión de 35 genes, capaz de realizar una buena clasificación clínica entre los cuatro grupos de pacientes analizados y el grupo control de sujetos sanos. Estos genes, podrían ser útiles como futuras herramientas de mejora para el diagnóstico y el tratamiento de la alergia. Además, se han encontrado genes que nunca antes han sido relacionados con enfermedades alérgicas.