Descripción molecular, fenotípica y transcriptómica de mute, un gen regulador positivo del desarrollo de estomas en arabidopsis

Resumen

El objetivo del trabajo de investigación de la Tesis que se presenta es la caracterización molecular y funcional de genes maestros de la diferenciación de estomas, en concreto, factores de transcripción, mediante mutagénesis inducida por EMS. En Arabidopsis, la diferenciación de estomas en la epidermis de los órganos aéreos requiere de la acción de una serie de reguladores positivos, imprescindibles para el inicio y progreso de los linajes celulares estomáticos. Recientemente, se han identificado varios genes pertenecientes a esta categoría mediante el análisis de mutantes de pérdida de función, que carecen de estomas. Uno de ellos es MUTE, que codifica una proteína bHLH responsable del tránsito de célula meristemática a célula madre de guarda en el desarrollo estomático. En el capítulo 1 de esta Tesis se presenta la caracterización fenotípica y molecular de los alelos mutantes mute-3 y mute-4, identificados en este laboratorio. Los individuos mute-3 y mute-4 inician los linajes estomáticos correctamente, pero los meristemoides prolongan sus rondas de divisiones asimétricas en espiral y nunca llegan a diferenciarse para formar estomas. A pesar de carecer de estomas, se desarrollan de forma similar a sus hermanos silvestres, aunque con un severo retraso en el desarrollo y presentando un porte enano. Si bien son capaces de sobrevivir durante más de cinco meses, en contadas ocasiones se ha llegado a completar el ciclo vital produciéndose semillas. Las lesiones moleculares de ambos mutantes predicen la falta total o muy severa de actividad de la proteína, lo que podría explicar la falta total de estomas en ellos. La severidad del alelo mute-3, junto con el porte enano y la reducida fertilidad de las plantas mutantes, dificultan el estudio de las funciones del gen MUTE y sus interacciones con otros genes. Con el objetivo de resolver este problema y desvelar información adicional sobre las funciones de MUTE, se ha recurrido a técnicas de genética reversa para obtener una serie alélica de MUTE que incluyese variantes de efecto reducido sobre los rasgos fenotípicos en estudio. Para abordar esta estrategia se ha colaborado con el servicio de TILLer (CNB, Madrid), el cual, basándose en la técnica TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) para detectar mutaciones en genes específicos, ha construido una colección permanente de familias M3 de la accesión Landsberg erecta glabrous1 (Ler,gl1) de Arabidopsis altamente mutagenizadas con EMS en las que pueden identificarse mutaciones en genes específicos mediante secuenciación. Mediante el estudio de dos caracteres ampliamente utilizados para caracterizar el fenotipo estomático (índice y densidad estomática) además de una característica típica de los alelos mute (la incidencia de linajes estomáticos detenidos), hemos determinado que existen fenotipos diferenciales entre las epidermis adaxial y abaxial de cotiledón, lo que apoya la idea de que existen diferentes rutas de desarrollo estomático en las dos epidermis foliares (Geisler y Sack, 2002; Shpak y col., 2005; Delgado y col., inédito), y que MUTE podría estar interactuando con el resto de genes implicados en el desarrollo de estomas de modo diferencial en las distintas epidermis del cotiledón. En el segundo capítulo de la Tesis nos planteamos resolver unos de los mayores problemas que presentan los mutantes severos en MUTE: la esterilidad de las plantas mute-3. Además, el fenotipo que muestran las plantas mute-3 es tan severo que no podemos distinguir qué fenotipos son causa directa de la ausencia de función de la proteína MUTE y cuáles son resultado de la carencia de estomas, lo que imposibilita el análisis de la función de MUTE en Arabidopsis. Así, hemos iniciado una aproximación basada en un sistema binario para la expresión condicional (inducible por ¿-estradiol) de proteínas en los dominios de acción de promotores específicos. A partir de los vectores diseñados por Curtis (Brand y col., 2006), hemos construido líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan condicionalmente MUTE específicamente en el dominio de expresión del promotor de MUTE. La generación de estas líneas nos ha permitido conocer determinados aspectos funcionales del gen MUTE, como el lapso de tiempo que conlleva la transición de meristemoide a célula de guarda, la posible señalización de las células del linaje con las que finalmente formarán las células de pavimento, que los meristemoides detenidos en mute-3 conservan todos los componentes necesarios para la transición de M a CMG y de CMG a CG excepto MUTE. También hemos obtenido resultados que sugieren que la expresión de MUTE en el M en su ventana temporal correcta es necesaria para que las células adyacentes no transiten a CMG y formen estomas. Finalmente, en el tercer y último capítulo de la Tesis nos planteamos el estudio comparativo de los transcriptomas asociados a la presencia de tipos celulares específicos en los linajes estomáticos, valiéndonos de la existencia de individuos portadores de mutaciones en los genes necesarios para transitar al siguiente tipo celular. Así, se han utilizado los cotiledones completamente expandidos de spch-3 (cuyas células epidérmicas no inician linajes estomáticos, por lo que su epidermis está compuesta únicamente de células de pavimento), mute-3 (en que los linajes se inician pero no se completa su diferenciación) y Col-0 (en que el desarrollo estomático procede normalmente hasta que la epidermis presenta únicamente células de guarda y del pavimento). Nuestros resultados indican que spch-3 difiere a nivel transcripcional de Col-0 mucho más que mute-3, lo que está de acuerdo con sus respectivos fenotipos epidérmicos. La epidermis de mute-3 presenta células específicas del linaje estomático en desarrollo, las cuales han completado el proceso en la epidermis de Col-0. Sin embargo, la epidermis de spch-3 está profundamente alterada, ya que carece por completo de todos los tipos celulares relacionados con el desarrollo estomático. Los cotiledones de spch-3 y mute-3 analizados en este experimento son morfológicamente similares en tamaño y aspecto general y su fisiología probablemente no difiere mucho, ya que ambos carecen de estomas y ambos deben realizar una fotosíntesis muy limitada; por lo tanto, las diferencias transcripcionales entre ellos (62 genes) podrían reflejar en buena medida sus distintas epidermis. Actualmente se está realizando un análisis más detallado de algunos de los genes diferencialmente expresados entre los dos mutantes que podrían tener relevancia para avanzar en la explicación molecular de ambos fenotipos y en la identificación de nuevos reguladores del desarrollo estomático. Los datos transcriptómicos descritos requieren un análisis más detallado, así como su comparación con otros transcriptomas, como los relacionados con otros mutantes alterados en el desarrollo de estomas (Bergmann y col., 2004; Hachez y col., 2011; Pilliteri y col., 2011). También es necesaria la profundización en el significado de estos cambios mediante otras aproximaciones experimentales, al menos para algunos de los genes más interesantes, que se elegirán por sus patrones de expresión (y su pertenencia a posibles regulones) y/o por su propia identidad si se conocen sus funciones. El análisis de los fenotipos de mutantes de inserción en algunos genes candidatos y de la sobreexpresión inducible para algunos de estos genes es otra aproximación que se está acometiendo en el laboratorio y que completará los resultados obtenidos en el presente trabajo.