Análisis y caracterización funcional de dos genes de tomate implicados en el proceso de micorrización

Resumen

Summary Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi are microscopic fungi that live in symbiosis with the roots of most plants. Among the benefits provided to the plants by this interaction we must highlight a better nutrition and a higher resistance to biotic and abiotic stresses. As both symbionts have coevolved for a long time, probably from the beginning of plant adaptation to the land environment, it is expected that the mechanisms for regulation of mycorrhizal development have also coevolved with plants. In this manner, the development and establishment of the AM symbiosis are fine-tuned regulated by environmental factors including nutritional conditions, as well as by molecular dialog and signalling mechanisms, and by a complex network of transcription factors and cofactors. The understanding of the symbiotic process and the key components for its regulation is essential in order to elucidate by what mechanisms the plant is benefited from the interaction with the AM fungi, and to develop strategies to improve the management of the mycorrhizal associations in order to use them as an alternative to the chemical fertilizers and pesticides. Our team work is focused in the analysis of the molecular processes underlying the AM symbiosis using the tomato plant, which constitutes a model plant for physiological and genetic studies and, in addition, it is a worldwide important crop. In this work, two AM-induced genes from tomato, tsb and SlDLK2, are subjected to their functional characterization and analysis, due to their possible role in the mycorrhization process. Particularly, tsb was chosen because of its possible function in cytoskeleton rearrangements during mycorrhization; while SlDLK2, encoding for a protein from the α,β-hydrolase family, because of its possible role as a relevant hormonal receptor involved in signalling during the mycorrhizal process. First of all, in order to quickly and easily screen the functionality of these genes during mycorrhization, a method for obtaining composite tomato plants using Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation was implemented. The resulting plants were composed of a transformed root system and a wild type aerial part. An optimized protocol was successfully set up for the transformation and generation of composite seedlings for mycorrhizal studies, with high success rates and that allows to undoubtedly identifying and selecting tomato cotransformed roots from the beginning until the harvesting time through visual selection using the fluorophore marker DsRed, without the requirement of antibiotics. Three different binary vectors were tested for silencing, overexpressing and promoter-GUS expression studies, that have allowed us to successfully perform a functional analysis of the candidate genes. This method, which have been recently published (Ho-Plágaro et al. 2018), is presented in Chapter 1 of this doctoral dissertation. The research carried out regarding the tsb gene is shown in Chapter 2. Tsb encodes a putative MAP (Microtubule Associated Protein) that belongs to a family of MAPs unique from Solanaceae plants. Some of the members of this MAP family have been previously described as pollen specific and with a function in cytoskeleton rearrangements and the formation of the pollen tube (Zhao et al. 2006; Huang et al. 2007; Liu et al. 2013). Here, through the analysis of tsb-silenced and tsb-overexpressing composite plants, a decreased expression was observed for genes related to arbuscule functionality in the AM tsb-silenced roots compared to the wildtype AM roots. In agreement with this result, tsb-overexpressing roots showed an induction all genes used as markers of arbuscule and fungal activities. Moreover, the cortical microtubule array seems to be perturbed in tsb-overexpressing roots. Microtubules and microfilaments are not only known to determine the structure of the cell and its organelles, but also to be involved in the intracellular transportation mechanisms, because they act as “tracks” for the clathrin vesicle trafficking, the main means of transport of the cell, consequently determining the endocytosis and exocytotic pathways. The results obtained in this work point to a role of tsb in restructuring the microtubule cytoskeleton in the cortical cells of the roots during mycorrhization and indicate that the action of tsb is related to the specific exocytosis processes for the delivery of proteins and compounds to the periarbuscular membrane and the symbiotic interface to allow arbuscule functionality and activity. The second gene studied in this work is a gene that encodes for a protein belonging to the α.β-hydrolase family, particularly to the DLK2 group. For this reason, it was named as SlDLK2. Curiously, the DLK2 protein group is phylogenetically very close to the strigolactone receptors (D14) and the karrikin receptors (KAI2). Strigolactones are plant hormones that play an important role in presymbiotic signalling during mycorrhization. In addition, the karrikin receptor KAI2 has been recently shown to be essential for the AM symbiosis (Gutjahr et al. 2015). However, DLK2 α.β-hydrolases are little characterized, and no relation has yet been found between DLK2 and the mycorrhization process. In Chapter 3 is presented our research work performed to elucidate if SlDLK2 is a signalling receptor important during MA symbiosis. Composite plants with transformed roots were obtained, and we observed that SlDLK2 silencing showed a significant increase of AM fungal development in the host roots. However, SlDLK2 overexpression gives place to an anomalous arbuscule development, with lack of branching, what suggest that SlDLK2 has a clear role in the development and branching of the arbuscules. Additionally, SlDLK2 has a conserved catalytic triad, responsible of the hydrolytic activity described for the strigolactone and karrikin receptors, and here we have actually probed that SlDLK2 retains some ability to interact and hydrolyse synthetic strigolactones. Although our research have not allowed us to elucidate the chemical structure of the specific ligand for SlDLK2, the results obtained so far point to the C13 α-ionols derivatives as the possible ligands. Finally, in Chapter 4, in order to clarify the possible signalling role of the SlDLK2 receptor during mycorrhization, transcriptomic alterations and the predicted changes in metabolic pathways in SlDLK2-silenced plants are shown, and the causes and consequences of these changes are discussed. Biggest changes observed were associated to a nutrient starvation and induced defence signature in the SlDLK2-RNAi mycorrhizal roots, probably as a consequence of the higher AM development and/or activity in these plants. However, examination of many other differentially expressed genes supports the idea of SlDLK2 as a negative regulator of mycorrhization, and that SlDLK2 might be important to activate GA signalling, restrict hexose production and carbohydrate supply to the AM fungus, and induce a number of resistance mechanisms, in order to control AM fungal development.   Resumen Los hongos micorrícico arbusculares (MA) son hongos microscópicos que viven en simbiosis con las raíces de la mayoría de las plantas. Entre los beneficios que aporta la formación de MA para las plantas caben destacar desde una mejor nutrición, hasta una mayor defensa ante estreses tanto bióticos como abióticos. Como consecuencia de la larga coevolución en simbiosis, dado que posiblemente esta asociación se formó desde el inicio de la adaptación de las plantas al medio terrestre, los mecanismos de regulación y control del desarrollo de la simbiosis han ido evolucionando a la par que la propia evolución de las plantas. Así, el desarrollo y establecimiento de la simbiosis MA están regulados muy finamente, tanto por condicionantes medioambientales incluyendo aspectos nutricionales, como por mecanismos de diálogo y señalización molecular, así como por una compleja red de factores y cofactores transcripcionales. La comprensión del proceso simbiótico y de los elementos clave en su regulación es esencial a la hora de averiguar los mecanismos por los que la planta es beneficiada en su interacción con los hongos MA, y desarrollar estrategias que permitan una mejor gestión de dicha asociación y de su aprovechamiento como alternativa al uso de fertilizantes químicos y plaguicidas. Nuestro equipo de trabajo está focalizado en desgranar los procesos moleculares que ocurren en la simbiosis MA, tomando como modelo la planta de tomate, ya que, además de suponer uno de los cultivos más importantes a escala mundial, es una planta muy adecuada para el estudio de la micorrización, entre otras razones por ser una planta modelo de estudios fisiológicos y genéticos. En este trabajo se ha realizado la caracterización y el análisis funcional de dos genes de tomate inducidos por micorrización, y denominados tsb y SlDLK2, candidatos a jugar un papel relevante en la simbiosis MA. Concretamente, uno de ellos, el tsb, se eligió por ser posiblemente importante para la reorganización del citosqueleto de las células de la raíz durante la micorrización, y el segundo de ellos, SlDLK2, por codificar para una proteína de la familia α/β-hidrolasa que podría ser un posible receptor hormonal relevante en la señalización del proceso micorrícico. Como primer paso y para evaluar de manera rápida y eficaz la funcionalidad de estos genes en la simbiosis MA, se ha implementado un método para la obtención de plantas “compuestas” de tomate, es decir, plantas con un sistema radical transformado pero con la parte aérea silvestre, generadas mediante transformación por Agrobacterium rhizogenes. Se ha conseguido un protocolo optimizado para la transformación y generación de plántulas compuestas para experimentos de micorrización con una gran tasa de éxito, y que además permite la identificación inequívoca de aquellas raíces transformadas desde el inicio hasta el momento de su cosecha mediante una selección visual, usando el fluoróforo DsRed, y sin necesidad de antibióticos. Se dispone de una colección de vectores binarios de transformación, tanto para experimentos de silenciamiento, sobrexpresión, o análisis de la actividad de promotores, que nos ha permitido realizar un análisis funcional de los genes objeto de estudio. Este método, que actualmente constituye una herramienta base en nuestro laboratorio, ha sido publicado recientemente (Ho-Plágaro et al. 2018) y es presentado en el Capítulo 1 de esta memoria de Tesis. La investigación desarrollada en torno al gen tsb se expone en el Capítulo 2. El gen tsb codifica para una putativa MAP (Proteína Asociada a Microtúbulos), perteneciente a una familia de MAPs exclusiva de Solanáceas, dentro de la cual algunos miembros han sido anteriormente descritos como específicos del polen y con una función en la restructuración del citosqueleto y en la formación del tubo polínico (Zhao et al. 2006; Huang et al. 2007; Liu et al. 2013). Aquí, a través del análisis de plantas compuestas silenciadas y sobreexpresadas para tal gen, se han obtenido resultados que muestran que, comparativamente con las raíces silvestres, en las raíces silenciadas se observa una disminución de la expresión de genes relacionados con la funcionalidad del arbúsculo. En consonancia, en las raíces con sobreexpresión del tsb se incrementa la inducción de todos los genes marcadores de la actividad arbuscular, así como de la actividad fúngica. Además, la organización de los microtúbulos corticales parece verse alterada en las células sobreexpresadas para el gen tsb. Los microtúbulos y microfilamentos no sólo se conocen por su papel en determinar la estructura de la célula y sus orgánulos, sino también por su implicación en los mecanismos de transporte intracelular, ya que actúan como las “vías de circulación” para el tráfico de las vesículas de clatrina, el principal medio de transporte en las células, y por lo tanto determinan las rutas de endocitosis y exocitosis. Los resultados de este trabajo apuntan a que el gen tsb está implicado en la restructuración del citosqueleto de microtúbulos (MT) en las células del córtex durante la micorrización y que su acción quizás sea especialmente importante en los procesos de exocitosis específicos para la liberación de proteínas y compuestos a la membrana periarbuscular y a la interfase simbiótica que permiten la correcta funcionalidad y actividad del arbúsculo. El segundo gen estudiado en este trabajo ha sido el gen que codifica para una proteína perteneciente a la familia α,β-hidrolasa, concretamente al grupo DLK2, de ahí que haya sido nombrada como SlDLK2. Curiosamente, el grupo de proteínas DLK2 está muy cercano filogenéticamente a los receptores de estrigolactonas (receptores D14) y de karrikinas (receptores KAI2). Las estrigolactonas son hormonas vegetales que tras ser exudadas por las raíces de las plantas juegan un papel importante en la señalización presimbiótica durante la micorrización. Por otra parte, recientemente se ha descubierto que el receptor de karrikinas, KAI2, parece ser esencial para la micorrización (Gutjahr et al. 2015). Sin embargo, las α,β-hidrolasas de tipo DLK2 están poco caracterizadas, y no existe en la literatura ninguna mención de su posible relación con la micorrización. En el Capítulo 3 se presenta la investigación realizada tratando de dilucidar si SlDLK2 es un receptor importante en la señalización durante la simbiosis MA. Los resultados con plantas compuestas con raíces transformadas mostraron que el silenciamiento de SlDLK2 provoca un incremento significativo del desarrollo del hongo MA en la raíz hospedadora, mientras que la sobreexpresión de SlDLK2 da lugar a una reducción de la colonización micorrícica y de su funcionalidad, así como a un desarrollo anómalo de los arbúsculos, carentes de ramificación, lo cual indica un papel claro de SlDLK2 en el desarrollo y ramificación de los arbúsculos. Además, SlDLK2 tiene conservada la tríada catalítica responsable de la actividad hidrolítica descrita para los receptores de estrigolactonas y karrikinas, y aquí hemos comprobado que efectivamente SlDLK2 tiene cierta capacidad de interaccionar e hidrolizar estrigolactonas sintéticas. No obstante, la investigación realizada hasta el momento no nos ha permitido aún elucidar la naturaleza química del ligando específico de SlDLK2, si bien los resultados apuntan a que quizás se trate de moléculas derivadas de los C13 α-ionoles. Finalmente, en el Capítulo 4, y con el objetivo de esclarecer la posible señalización mediada por el receptor SlDLK2 durante la micorrización, se presentan los resultados del análisis de las alteraciones transcriptómicas que sufren las plantas micorrizadas al ser silenciadas para SlDLK2, así como se discuten las causas y/o consecuencias de dichos cambios en función de las rutas metabólicas afectadas. Los cambios más destacables que presentaron las raíces SlDLK2 RNAi micorrizadas parecen estar relacionados con una situación de deficiencia nutricional y con la activación de mecanismos de defensa, lo cual podría ser interpretado como una consecuencia del mayor desarrollo y/o actividad micorrícica en dichas plantas. Sin embargo, al examinar en detalle otros genes diferencialmente expresados, los resultados apoyan la idea de que SlDLK2 actúe como un regulador negativo de la micorrización, pudiendo jugar un papel importante en la activación de la señalización mediada por giberelinas, restringiendo la producción de hexosas y el aporte de hidrocarburos al hongo, así como induciendo una serie de mecanismos de resistencia a fin de controlar el desarrollo fúngico.