Identificación de proteínas implicadas en la interacción arabidopsis-pseudomonas mediante tecnología "phage-display". caracterización funcional de aterf1 y erf1 en respuesta a estrés

Resumen

[ES] Las plantas están en continua interacción con el ambiente y debido a su naturaleza sésil, han evolucionado y desarrollado complejos mecanismos de respuesta al ataque de patógenos (estrés biótico) o a las condiciones adversas (estrés abiótico). En esta Tesis se ha profundizado en los mecanismos moleculares de las respuestas a estrés, tanto biótico como abiótico en Arabidopsis thaliana . En el primer capítulo de este trabajo se ha estudiado la interacción Arabidopsis- Pseudomonas desarrollando una nueva estrategia para la búsqueda de proteínas vegetales implicadas en la percepción del patógeno. Empleando la tecnología phagedisplay se ha expresado el transcriptoma de Arabidopsis en respuesta a tres cepas bacterianas (P.aeruginosa PA14, el aislado virulento P.syringae DC3000 y su variante avirulenta P.syringae DC3000+avrRpt2) representando así, diferentes grados de especificidad en la interacción planta-microorganismo. Las genotecas “phage display”, construidas a partir de cDNA de plantas infectadas, representan aproximadamente 2x107 transcritos vegetales diferentes que se expresan de forma funcional en la superficie del fago T7. Mediante una técnica complementaria denominada biopanning, se han seleccionado e identificado aquellos fagos individuales que expresen una proteína heteróloga capaz de unirse físicamente a células bacterianas, entre ellos ATERF-1 (Factor de Transcripción de Respuesta al Etileno 1). El papel de ATERF-1 en respuesta al patógeno ha sido también demostrado in vivo. Se ha estudiado la localización de ATERF-1 en plantas de Tabaco y Arabidopsis y se ha visto que la construcción GFP-ATERF-1 se transloca desde el núcleo al citoplasma tras el contacto con la bacteria. Adicionalmente, el mutante de pérdida de función aterf-1 es más susceptible a la infección que el genotipo silvestre Col-0, demostrando así, el papel de la proteína en la respuesta inmune. La selección de clones con afinidad física por células vivas de Pseudomonas ha sido monitorizada mediante la hibridación de microarrays con el objeto de comparar la colección de clones inicial vs. seleccionados. Esto ha permitido por una parte cuantificar el enriquecimiento de clones específicos, y por otra identificar un total de 418 genes de Arabidopsis que posiblemente participen en la percepción de Pseudomonas, o que puedan tener afinidad por alguna de las partes del microorganismo. De entre todos estos genes, algunos ya estaban anotados como genes de defensa y otros podrían ser anotados a partir de este estudio. En el segundo capítulo de esta tesis, se ha estudiado el papel de ERF1 en la respuesta a estrés abiótico. Esta proteína pertenece a la misma familia que ATERF- 1, identificada en el cribado de la primera parte de esta tesis, y es el miembro mejor estudiado de la subfamilia AP2/ERF (Apetala 2/Factores de transcripción de Respuesta al Etileno) en relación con la respuesta a patógenos necrótrofos y a la integración de las señales de Etileno (ET) y Jasmónico (JA). En esta Tesis se ha demostrado que la sobreexpresión de ERF1 en plantas adultas confiere tolerancia a la sequía y desreprime a los factores de transcripción AtERF4 y DEAR5, propuestos como dianas directas de la regulación transcripcional por ERF1. Esta respuesta mediada por ERF1 es también dependiente de EIN2, un componente clave de la ruta de señalización por ET. Por otro lado, plantas transgénicas que sobreexpresan ERF1 presentan un retraso en el desarrollo temprano de plántulas cuando son sometidas a otros estreses abióticos (salino y osmótico), o cuando son tratadas con la fitohormona Ácido Abscísico (ABA), que regula el cierre de los estomas en las hojas como respuesta a la sequía. El retraso en la germinación de semillas está relacionado con un aumento en los niveles de ABI5, una proteína clave en el proceso post-germinativo que se acumula en semillas transgénicas que sobreexpresan ERF1. Por último, en este trabajo se ha demostrado que ERF1 es epistático en la ruta de señalización del ABA y que actúa debajo de HAB2, una proteín-fosfatasa de tipo PP2C implicada en el complejo receptor del ABA y que actúa como regulador negativo, dando evidencias de una interacción hormonal ET-ABA durante el establecimiento de la plántula en Arabidopsis.