Inhibición de las rutas de ubiquitinación de proteínas dependientes de complejos Cullin-RING Ligasa en Sarcoma de EwingValidación preclínica y caracterización de mecanismos moleculares

Resumen

[ES]El Sarcoma de Ewing (SE) es una neoplasia maligna de hueso y de partes blandas que afecta preferencialmente a adolescentes y adultos jóvenes. Gracias a los avances en terapia multimodal en pacientes con enfermedad localizada la tasa de supervivencia actual es del 70% a 5 años. Sin embargo, esta cifra es aún inferior al 20% en los pacientes con enfermedad primaria diseminada o recaída. El SE se define molecularmente mediante translocaciones cromosómicas balanceadas, que dan lugar a genes de fusión, que a su vez se traducen en proteínas quiméricas (EWSR1-ETS) funcionales cuya acción oncogénica es el evento molecular principal del SE, habitualmente EWSR1-FLI1 (85% de los casos), un potente factor de transcripción aberrante. No obstante, existen claras evidencias de que las alteraciones secundarias subyacentes a la fusión juegan un papel fundamental en el desarrollo y progresión tumoral así como en el pronóstico del paciente. Nuestro grupo ha propuesto que la ganancia del número de copias de 1q (o 1qG) presente en el 30% de los tumores de SE y la sobreexpresión de un gen situado en dicha región genómica (CDT2 o DTL) son dos nuevos marcadores que conllevan un pronóstico adverso para los pacientes en estudios retrospectivos. Este trabajo, que integró estudios genómicos de número de copia y perfiles transcriptómicos de 103 muestras de tumores primarios de SE, demostró una mayor tasa proliferativa de los tumores 1qG-CDT2 concomitante con una desregulación del ciclo celular. Dado que CDT2 pertenece a un subtipo de complejos con actividad ubiquitina ligasa (conocidas como Cullin-RING ligasas, CRL), y puesto que existe un potente inhibidor específico de estos complejos (MLN4924 de Millennium Pharmaceuticals, Inc (Takeda Oncology Company, Cambridge, MA, USA)) se decidió ensayar la efectividad de MLN4924 en líneas celulares de SE. MLN4924 se encuentra en ensayos clínicos fase II en EEUU y los resultados de la fase I en tumores sólidos indican una buena tolerancia en humanos. Este fármaco inhibe la enzima NAE (NEDD8 activating enzyme) imposibilitando la nedilación esencial para la actividad de las enzimas E3 ligasas que forman parte de los complejos CRL. Ello impide la poli-ubiquitinación y posterior degradación en el proteosoma de potentes supresores tumorales como p21, p27, IKB¿, WEE1, etc. Nuestros resultados in vitro e in vivo demuestran que las líneas celulares de SE son muy sensibles al fármaco (media de IC50 de 14 líneas celulares de SE¿ 81nM). Funcionalmente en SE, MLN4924 disminuye la nedilación de los complejos CUL1, CUL4A y CUL4B al mismo nivel que la línea celular de cáncer colorrectal HCT116. Sin embargo los niveles de CDT1 (propuesto como principal marcador farmacodinámico) suben ligeramente con respecto a HCT116, en la que los altos niveles de CDT1 provocan re-replicación. Además, el ciclo celular de las células de SE es alterado de manera diferente según la concentración del fármaco: A concentraciones 30-300nM (rango comprendido entre IC50 e IC90) observamos el retraso en fase G2 y el acúmulo de p21, p27, WEE1, CDC25A, Ciclina E. WEE1, que regula la progresión del ciclo mediante fosforilación de CDK1 en la tirosina 15 deteniendo la transición G2-M, se acumula provocando la alteración de la progresión del ciclo en este punto. El efecto de MLN4924 es revertido al inhibir WEE1 mediante un fármaco específico (PD0166285) o RNA de interferencia (shRNA), lo cual demuestra que WEE1 es el principal efector del retraso en G2. A concentraciones altas de MLN4924 (300-1000nM), la progresión del ciclo se ralentiza drásticamente en fase S tardía y provoca daño en el ADN. Sugerimos que el retraso a altas concentraciones se debe al acúmulo de WEE1 y la consecuente fosforilación de CDK2 en la tirosina 15, así como el desplazamiento de Ciclina A por Ciclina E en su unión a CDK2 en la etapa final de la fase S. Este desplazamiento altera el patrón de fosforilación de sustratos de CDK2 en fase S tardía. Un ejemplo es la localización sub-celular de CDC6 en la etapa final de la fase S; en las células tratadas con MLN4924 a alta concentración, CDC6 permanece en el núcleo en fase S tardía. La sobreexpresión exógena de Ciclina E o Ciclina A provoca un retraso en la progresión de la fase S tardía o temprana respectivamente, en las células de SE. MLN4924 a una concentración de IC75 específica de cada línea celular, así como a 1µM, junto al fármaco Doxorrubicina (DXR), actúan de manera sinérgica al tratar las líneas celulares de SE. Derivado de todos estos estudios preclínicos, proponemos el uso del fármaco MLN4924 como una prometedora herramienta terapéutica en pacientes de SE. Además proponemos a WEE1, p27 y Ciclina E como marcadores farmacodinámicos en futuros ensayos clínicos.