La activación de la E3 Ubiquitina ligasa APC/C-Cdh1 es esencial para la supervivencia neuronal. Desarrollo de un modelo murino de neurodegeneración in vivo

Resumen

[ES] Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la esclerosis lateral amiotrófica, cursan con la pérdida de poblaciones neuronales específicas. Con pocas excepciones, las causas etiopatológicas de estas enfermedades son, en gran medida, desconocidas e incluso en los casos en los que han sido identificados los mecanismos, éstos son aún especulativos. Sin embargo, es llamativa la presencia de similitudes en los procesos neurodegenerativos a nivel celular y molecular y las semejanzas en el desarrollo de las respuestas encefálicas, incluso en procesos con origen muy diferente. La neurodegeneración es un proceso considerado irreversible y que produce una destrucción sistemática y pautada de los componentes nucleares y citoplasmáticos de las neuronas afectadas. Ello hace que las enfermedades neurodegenerativas supongan actualmente un enorme coste personal, sanitario y socioeconómico. Como primer paso para evaluar estrategias en el tratamiento de estas neuropatologías, o al menos retrasar su aparición o ralentizar su progresión, se hace necesario conocer los mecanismos previos a la muerte celular, caracterizar los acontecimientos que se suceden durante el proceso y las etapas identificables anteriores a la degeneración neuronal, determinar los factores tanto celulares como bioquímicos que son capaces de modificar la progresión normal de este proceso. Por todo ello, es esencial disponer de modelos animales que emulen el proceso neurodegenerativo completo. El ciclo celular se define como el conjunto de procesos a partir de los cuales, de una célula madre se obtienen dos células hijas con la misma información genética. A lo largo del ciclo celular debe existir una coordinación entre el crecimiento de las células y su división. La condición esencial para que ocurra la división celular es que la célula madre transmita adecuadamente su información genética a las dos células hijas. Para ello, el DNA ha de ser replicado de forma exacta y única en cada ciclo, y las cromátidas hermanas obtenidas deben ser segregadas a cada una de las nuevas células. Se ha descrito un complejo multiproteico denominado complejo promotor de la anafase/ciclosoma (APC/C), que contiene la actividad E3 Ubiquitina ligasa que cataliza la unión de múltiples moléculas de Ubiquitina a las ciclinas. Este complejo está formado por al menos 13 proteínas diferentes. Se ha descrito una proteína con 7 repeticiones de dominios WD, denominada Cdh1, que es necesaria para el reconocimiento de la ciclina por el complejo APC/C . Cdh1 es una proteína que está regulada negativamente por los complejos Cdk/ciclina, de manera que en su estado fosforilado no interacciona con APC/C y, por tanto, es inactivo y cuando está desfosforilada interacciona con APC/C y promueve la degradación de la ciclina B1. Por todo ello, Cdh1 se considera una proteína supresora tumoral. Existen varias evidencias experimentales de que Cdh1 es uno de los reguladores más importantes de las fases G1 y G0 del ciclo celular. Su importancia para el mantenimiento de estas fases se deduce del hecho de que las células entran en fase S más fácilmente tras su inhibición o ausencia. Cdh1 no se expresa durante los primeros ciclos de división embrionarios, los cuales carecen de fases G1 y G2, coincidiendo el comienzo de su expresión con la adquisición de fase G1. La actividad de APC/C-Cdh1 está regulada por el nivel proteico y el estado de fosforilación de Cdh1, así como por la unión de proteínas inhibidoras o activadoras. En los últimos años, otros autores y nuestro grupo han descrito la presencia de Cdh1 y diferentes subunidades de APC/C en el cerebro de ratón, así como en cultivos de neuronas corticales. Recientemente, en nuestro laboratorio hemos demostrado que la actividad de APC/C-Cdh1 es esencial para la supervivencia neuronal in vitro (cultivos primarios de neuronas de rata). La inhibición de la actividad de la ligasa, mediante el silenciamiento por tratamiento con siRNA del activador Cdh1 o la sobre-expresión del inhibidor de la ligasa, Emi1, en las neuronas provoca la muerte neuronal mediante un mecanismo que implica la acumulación de la ciclina mitótica B1. De hecho, la expresión de ciclina B1 es, por sí misma, una potente neurotoxina. Cdh1 y el Sistema Nervioso: El crecimiento axónico es un proceso esencial en el establecimiento de las conexiones entre neuronas. Depende de factores externos del ambiente y también de programas intrínsecos de la célula, que gobiernan tanto el crecimiento como el patrón de los axones. En concreto, existen evidencias que sugieren un papel importante de APC/C-Cdh1 en la morfogénesis de los axones en el cerebro de mamíferos, al marcar para su degradación a los reguladores transcripcionales SnoN e Id2. Se ha puesto de manifiesto que APC/C-Cdh1 controla el desarrollo y la transmisión sináptica al regular la localización de receptores de glutamato, tipo AMPA. Se ha descrito una función presináptica de APC/C-Cdh1 en la restricción del número de botones y otra postsináptica en la restricción de la abundancia de receptores de glutamato, resaltando su importancia en el desarrollo y funcionamiento de las sinapsis. Por otra parte, se ha descrito la implicación de APC/C-Cdh1 en la plasticidad sináptica y los procesos de memoria y aprendizaje. Las neuronas poseen menor tasa glucolítica que los astrocitos y, a diferencia de ellos, son incapaces de aumentarla bajo condiciones de estrés. Ello es consecuencia de los bajos niveles de Pfkfb3 (6-fosfofructo-2-kinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa) que expresan, a diferencia de las células gliales. Esta enzima genera fructosa-2,6-bisfosfato, el activador más potente de la 6-fosfofructo-1-kinasa, principal regulador de la glucólisis. Recientemente, en nuestro laboratorio se ha descrito que APC/C-Cdh1 es la E3 Ubiquitina Ligasa responsable de regular los niveles proteicos de Pfkfb3 y, por tanto, la actividad glucolítica neuronal. De este modo, APC/C-Cdh1 mantiene baja la tasa glucolítica en las neuronas, posibilitando la utilización de la glucosa para otras funciones, como es el mantenimiento del estado antioxidante de las mismas. El ciclo celular y la viabilidad neuronal se han asociado bajo la hipótesis de que la re-entrada de las neuronas en el ciclo celular causa su muerte por apoptosis. Por tanto, nuestro laboratorio ha descrito una nueva función neuroprotectora de Cdh1, necesaria para promover la degradación de la ciclina B1 y, de ese modo, prevenir una entrada aberrante de las neuronas en el ciclo celular. Actualmente se sabe que Cdh1 regula la supervivencia neuronal, el crecimiento axónico, la sinaptogénesis y el metabolismo glucídico en neuronas en cultivo primario. Sin embargo, se desconoce la trascendencia de estas funciones in vivo. En esta Tesis Doctoral nos propusimos investigar la función de Cdh1 en cerebro y su relevancia en la supervivencia neuronal in vivo. Para ello, se utilizaron ratones knockout para Cdh1 en zonas específicas del cerebro, de manera condicional a la expresión de CaMKIIalfa-Cre. Nuestros resultados han mostrado que la eliminación de Cdh1 induce el acortamiento de la corteza cerebral y de la capa CA1 del hipocampo, de manera dependiente del tiempo, sugiriendo una pérdida selectiva de neuronas. Estos resultados corroboran in vivo la función esencial de Cdh1 en la supervivencia neuronal.