Función del factor transcripcional de tipo MADS-box, AGAMOUS-LIKE 67 (AGL67), en la señalización hormonal durante la germinación de semillas de Arabidopsis thaliana

Resum

[ES] El inicio de la germinación de una semilla es una etapa clave en el ciclo de vida de una planta. Un embrión de pocas células en estado quiescente o durmiente rompe la cubierta que le rodea e inicia un complejo programa de desarrollo que le conducirá en último término a la formación de una planta adulta. Bajo esta perspectiva, se entiende que este proceso esté altamente regulado por factores internos y ambientales. La semilla puede definirse como el producto maduro de un óvulo fecundado del cual partirá un nuevo individuo vegetal. Su función es la de multiplicar y perpetuar la especie a la que pertenece. Por lo tanto, es uno de los elementos más eficaces para que la especie se disperse, en el tiempo y en el espacio (Nambara y Nonogaki, 2012). Las semillas son un pilar fundamental para la actividad humana. Su utilización permitió el desarrollo de la agricultura, dando lugar a uno de los mayores cambios históricos. El desarrollo de nuevas tecnologías para aumentar, tanto la mejora de los cultivos como la seguridad alimentaria puede llevarse a cabo intentando determinar la genética de desarrollo y la química de las reservas de las semillas. Las semillas utilizadas bien como alimento para el hombre o bien como alimento animal suponen más de un 70% de las entradas calóricas a nivel mundial y este conocimiento podría tratar de paliar las demandas alimentarias en una población mundial en aumento (Revisado por Martínez-Andújar et al., 2012). El uso de semillas como fuente de biocombustibles ayuda a mejorar la calidad de vida y la economía local de países en vías de desarrollo, debido a que la energía producida por estos biocombustibles puede usarse por ejemplo, como electricidad (Gilbert, 2011). La ciencia de las semillas es un área de gran relevancia dentro de la Fisiología Vegetal. La secuenciación del genoma completo de Arabidopsis thaliana ha permitido disponer de una valiosa herramienta de investigación, empleándose como modelo para comprender la biología de numerosos cultivos. Con la finalidad de asegurar la supervivencia de la especie, en plantas superiores, la formación de semillas combina el desarrollo del embrión con una serie de procesos fisiológicos y un control por parte de factores hormonales y ambientales. La célula vegetal debe percibir el estímulo y poner en funcionamiento un complejo mecanismo de transmisión de la señal hasta el núcleo, que en último lugar active la expresión de genes específicos. Los avances en estudios a nivel transcriptómico (Ogawa et al., 2003, Nakabayashi et al., 2005, Penfiel et al., 2006, Carrera et al., 2007, Spencer et al., 2007, Day et al., 2008, Preston et al., 2009, Linkies et al., 2009, Le et al., 2010, Okamoto et al., 2010, Yamamoto et al., 2010), a nivel proteómico (Rajjou et al., 2004, 2008) y a nivel metabólico (Kliebenstein et al., 2001, Fait et al., 2006, Lepiniec at al., 2006, Macquet et al., 2007, Bai et al., 2012) han permitido ampliar el conocimiento sobre la biología de semillas de Arabidopsis. Las hormonas vegetales tienen un papel fundamental en la regulación de las diferentes etapas a lo largo de la vida de una planta. Existen varias sustancias reguladoras del crecimiento que actúan como moléculas señalizadoras en la germinación de semillas (Koornneef et al., 1982, Karssen et al., 1983, Satler et al., 1985, Abeles, 1986, Nambara et al., 1991, Wilen et al., 1991, Giraudat et al., 1992, Staswick et al., 1992, Melan et al., 1993, Bleecker et al., 1998, Steber et al., 1998, Beaudoin et al., 2000, Beligni y Lamattina, 2000, Ghassemian et al., 2000, Lovegrove y Hooley, 2000, Hays et al., 2001, Lopez-Molina et al., 2001, Steber y McCourt, 2001, Ellis y Turner, 2002, Friml et al., 2002, Friml et al., 2003, Gazzarrini y McCourt, 2003, Nambara y Marion-Poll 2003, Chen et al., 2004, Ali-Rachedi et al., 2004, Kushiro et al., 2004, Yamauchi et al., 2004, Chiwocha et al., 2005, Weijers y Jürgens, 2005, Achard et al., 2006, Bethke et al., 2006, Bentsink et al., 2006, Libourel et al., 2006, Millar et al., 2006, Penfield et al., 2006, Pirrello et al., 2006, Sarath et al., 2006, Seo et al., 2006, Liu et al., 2007, Ariizumi y Steber 2007, Li et al., 2007, Yamaguchi et al., 2007, Holdsworth et al., 2008, Finkelstein et al., 2008, Piskurewicz et al., 2008, Linkies et al., 2009, Penfield y Hall, 2009, Preston et al., 2009, Bentsink et al., 2010, Liu et al., 2010, Nakabayashi et al., 2010, Kanno et al., 2010, Fernández-Arbaizar et al., 2012). Estudios previos sugieren que el factor de transcripción de la familia MADS-BOX AGL67 es un regulador negativo clave en el proceso de germinación. El transcrito AGL67 tiene un máximo en semilla seca y coexpresa con un elevado número de genes relacionados con la ausencia de germinación (Bassel et al., 2011). Sus niveles aumentan en condiciones que inhiben o dificultan la germinación (Bassel et al., 2008); y decaen tras el proceso de imbibición hasta niveles prácticamente imperceptibles (Nakabayashi et al., 2005). Asimismo, semillas mutantes en este gen tienen menor grado de dormición que el tipo silvestre (Nambara, comunicación personal, 2010, Bassel et al., 2011). Sin embargo, las evidencias directas de la localización del transcrito y la proteína en la semilla, la regulación de la acumulación de AGL67 y la ruta de señalización de este factor de transcripción son todavía en gran parte desconocidas. En colaboración con el Dr. Eiji Nambara (Universidad de Toronto, Canadá), el objetivo principal que se plantea en este trabajo es identificar nuevos componentes moleculares implicados en la ruta de señalización de AGL67 y su conexión con las dos principales hormonas que regulan la germinación, el ABA y las GAs. Para ello, utilizamos Arabidopsis thaliana como sistema modelo por las características propias de esta planta: genoma de pequeño tamaño y completamente secuenciado, amplias colecciones de mutantes y herramientas genéticas y por la facilidad de su manejo en el laboratorio. Los factores de transcripción regulan la expresión de genes. El control de su actividad es crucial en el comienzo de la germinación. Los genes pertenecientes a la familia MADS-box codifican factores de transcripción que juegan papeles importantes en un amplio rango de organismos eucariotas (levaduras, plantas, insectos, anfibios y mamíferos). Así, en levadura, el factor de transcripción MCM1 es necesario en la respuesta a feromonas. En Drosophila, SRF interviene en la regulación del desarrollo de la tráquea. En mamíferos, RSRF/MEF2 están implicados en la transcripción de genes específicos de músculo. En plantas, un elevado número de factores de transcripción pertenecientes a esta familia génica muestran relación con el desarrollo de órganos florales. En Arabidopsis, esta familia comprende más de cien genes con funciones descritas en prácticamente cualquier etapa del desarrollo de la planta (Snaczniak et al., 2012). Aunque son numerosos los genes de la familia MADS-box que se expresan durante el desarrollo del embrión y la semilla en Arabidopsis thaliana (Lehti-Shiu et al., 2005, Bemer et al., 2008, Colombo et al., 2008, Kang et al., 2008, Bermet et al., 2010), únicamente a unos pocos se les ha atribuido una función específica en esta etapa del desarrollo (Heck et al., 1995, Perry et al., 1999 Harding et al., 2003, Thakare et al., 2008, Zheng et al., 2009). El nombre MADS-box proviene de las iniciales de los genes de Saccharomyces cerevisiae, MINICHROMOSOME MAINTENANCE1 (MCM1), AGAMOUS (AG) en Arabidopsis thaliana, DEFICIENS (DEF) en Anthirrinum majus y SERUM RESPONSE FACTORS (SRF) en Homo sapiens (Schwarz-Sommer et al., 1990). Esta familia de proteínas se caracteriza por la presencia de un dominio de unión a DNA altamente conservado a lo largo de la evolución y denominado dominio MADS (Messenguy et al., 2003). Los factores de transcripción MADS-box actúan en forma de homo o heterodímeros. Estos complejos multiméricos se unen a una región presente en la zona promotora de los genes diana, conocida como caja CArG, constituida por los nucleótidos 5¿-CC(A/T)6GG-3¿ o a secuencias muy similares (Kauffman et al., 2009, Zobell et al., 2010). Existen similitudes entre el dominio MADS y la subunidad A de la topoisomerasa IIA (TOPOIIA-A). Diferentes estudios sugieren que la TOPOIIA-A sufrió una duplicación en un antecesor común de todos los eucariotas. Una de las copias mantuvo actividad topoisomerasa, necesaria entre otras funciones para la replicación del DNA, mientras que la otra copia llegó a ser el antecesor común de los miembros de la familia MADS-box, necesaria para la unión a la secuencia CArG presente en el promotor de los genes diana (Revisado por Gramzow et al., 2010). Análisis filogenéticos en plantas han permitido obtener una clasificación de los miembros de la familia génica MADS-box. Éstos han sido divididos en dos subfamilias: subfamilia génica tipo I, que a su vez se divide en 3 grupos (M¿, Mß y M¿) en función de la presencia o ausencia de motivos conservados en la región carboxi-terminal de la proteína (De Bodt et al., 2003, Paternicová et al., 2003, Yoo et al., 2006); y subfamilia génica tipo II, dividida en los grupos MICKC y MICK*. Esta clasificación se basa en el número de exones que codifican el dominio I de la proteína y por las diferencias estructurales del dominio K (Henschel et al., 2002). A su vez, las proteínas MICK* pueden dividirse en clase S y clase P. Ambas subfamilias (tipo I y tipo II) presentan una serie de rasgos diferenciales que se detallan a continuación: Los genes pertenecientes a la subfamilia tipo I constan de 1 o 2 exones, mientras que los genes pertenecientes a la subfamilia tipo II presentan una media de 7 exones (De Bodt et al., 2003). Los genes pertenecientes a la subfamilia tipo I muestran un mayor índice de natalidad-mortalidad en comparación a los genes pertenecientes a la subfamilia tipo II (Nam et al., 2004). Los genes pertenecientes a la subfamilia tipo I han sufrido duplicaciones génicas en una escala menor que los genes pertenecientes a la subfamilia tipo II (Bemer et al., 2010). Estudios con mutantes de Arabidopsis thaliana han permitido demostrar que los genes pertenecientes a la subfamilia tipo I presentan importancia durante el desarrollo de la semilla, saco embrionario y gametofito femenino. Así, mutantes agl23 presentan detenido el desarrollo del gametofito femenino (Colombo et al., 2008). Los factores de transcripción AGL80 y AGL61 actúan formando dímeros en la diferenciación de la célula central del gametofito femenino (Bemer et al., 2008, Portereiko et al., 2006). AGL37 presenta un importante papel durante el desarrollo de la semilla (Kohler et al., 2003). Además, mutantes agl62 sufren una formación prematura de las paredes celulares en el endospermo (Kang et al., 2008). Dentro de los genes de la subfamilia tipo II, los más ampliamente estudiados son los pertenecientes al grupo MICKC (revisado por Becker y Theissen, 2003, De Bodt et al., 2003, Kaufman et al., 2005, Liu y Mara, 2010, Melzer et al., 2010). En musgos y helechos, estos genes se expresan en el esporofito y en el gametofito. En Arabidopsis, AGL18 es el único gen cuya expresión se encuentra localizada en el gametofito. Los genes pertenecientes a este grupo filogenético controlan varios aspectos del desarrollo del esporofito. De este modo, son capaces de determinar el tiempo de floración, como es el caso de SUPPRESSOR OF CONSTANS1 (SOC1), FLOWERING LOCUS C (FLC), AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24), MADS AFFECTING FLOWERING1 (MAF1) y SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP); la identidad del meristemo floral, como APETALA1 (AP1), FRUITFULL (FUL), CAULIFLOWER (CAL); la identidad del órgano floral, como AP1, SEPALLATA1 (SEP1), SEPALLATA2 (SEP2), SEPALLATA3 (SEP3), SEPALLATA4 (SEP4), APETALA3 (AP3) y AGAMOUS (AG); la formación del fruto, como SHATTERPROOF1 (SHP1), SHATTERPROOF2 (SPH2) y FRUITFULL (FUL) y la pigmentación de la semilla, como ARABIDOPSIS BSISTER (ABS). Por otro lado, los genes pertenecientes al grupo MICK* se descubrieron posteriormente. Sus funciones están asociadas con el desarrollo del gametofito, y coinciden con el lugar de expresión. En Arabidopsis, la expresión de estos genes se encuentra en el gametofito masculino Adamczyk et al. (2009) comprobaron que el desarrollo del tubo polínico y la maduración del polen está mediada por la formación de heterodímeros entre 5 de los 6 miembros de este grupo: AGL30, AGL104, AGL66, AGL65 y AGL94. El análisis de la secuencia aminoacídica de la proteína AGL67 con el resto de proteínas pertenecientes al grupo MICK* (AGL30, AGL104, AGL66, AGL65 y AGL94) revela la alta conservación del dominio MADS característico de esta familia génica. Para tener un mayor conocimiento sobre el grado de conservación de AGL67 a lo largo de la evolución, se realizó un estudio comparativo de esta proteína de Arabidopsis thaliana y de sus homólogas en las diferentes especies de plantas presentes en la base de datos phytozome (www.phytozome.net). Los datos obtenidos nos indican que el clado constituido por las algas (Chlamydomonas reinharditii, Volvox carteri, Coccomyxa subellipsoidea C-169, Micromonas pusilla CCMP1545, Micromonas pusilla RCC299, Ostreococcus lucimarinus) carece de AGL67, lo que sugiere la importancia de los miembros de esta familia en diferentes procesos del desarrollo tras la colonización del medio terrestre. Por otro lado, la alta similitud entre el árbol de especies y el árbol de AGL67 en la familia de las Brasicáceas sugiere un elevado nivel de conservación de este gen y por lo tanto su transcendencia dentro de la familia génica MADS-box. 1. AGL67 actúa como represor del inicio de la germinación en la ruta de señalización de las giberelinas (GAs). La familia de factores de transcripción MADS-box en Arabidopsis comprende más de cien genes con funciones descritas en prácticamente cualquier etapa del desarrollo de la planta (Snaczniak et al., 2012). Uno de los ejemplos mejor estudiados es la floración. Así, factores de transcripción de esta familia regulan la expresión de genes que son esenciales para el crecimiento, forma y estructura de las flores (Ito, 2011, Dornelas et al., 2011). Aunque son numerosos los genes de la familia MADS-box que se expresan durante el desarrollo del embrión y la semilla en Arabidopsis thaliana, como es el caso de PHERES1 (PHE1), DIANA (DIA), AGL23, AGL62, AGL28, AGL40, AGL57, AGL59, AGL64, PHE2, AGL35, AGL36 y AGL90 (Lehti-Shiu et al., 2005, Bemer et al., 2008, Colombo et al., 2008, Kang et al., 2008, Bermet et al., 2010), únicamente a unos pocos se les ha atribuido una función específica en esta etapa del desarrollo (Heck et al., 1995, Perry et al., 1999, Harding et al., 2003, Thakare et al., 2008, Zheng et al., 2009). En este sentido, AGL15 actúa sobre los genes LEC2, FUSCA3 y ABI3 que a su vez presentan un papel clave durante la embriogénesis. Un patrón similar de expresión ha sido descrito para diferentes miembros de factores de transcripción de esta familia génica en arroz y en cebada (Arora et al., 2007, Lin-lin et al., 2012, Kapazoglou et al., 2012, Papaefthimiou et al., 2012). Estudios previos sugieren que el factor de transcripción AGL67 es un regulador negativo clave en el proceso de germinación: (1) El transcrito tiene un máximo en semilla seca y coexpresa con un elevado número de genes relacionados con la ausencia de germinación (Bassel et al., 2011) (Figura 2); (2) sus niveles aumentan en condiciones que inhiben o dificultan la germinación (Bassel et al., 2008); (3) sus niveles decaen tras el proceso de imbibición hasta niveles prácticamente imperceptibles (Nakabayashi et al., 2005); y (4) semillas mutantes en este gen tienen menor grado de dormición que el tipo silvestre (Bassel et al., 2011). Estos resultados tomados en su conjunto sugieren que AGL67 desempeña un papel fundamental como represor de la germinación, pudiendo actuar de forma análoga al gen FLOWERING LOCUS C (FLC), también perteneciente a la familia MADS-box, y que actúa como represor en el inicio de la floración (Chiang et al., 2009). Sin embargo, las evidencias directas de la localización del transcrito y la proteína en la semilla, la regulación de la acumulación de AGL67 y la ruta de señalización de este factor de transcripción son todavía en gran parte desconocidas. La utilización de una línea ¿gene-trap¿ en el gen AGL67 nos ha permitido visualizar la acumulación del transcrito en los últimos estadios de la embriogénesis. Mediante la detección de la actividad glucuronidasa (GUS) asociada a esta línea hemos confirmado, de este modo, los resultados obtenidos por Bassel et al. (2011) tras recopilación de numerosos estudios transcriptómicos para los genes implicados en la transición entre dormición y germinación. Estos autores muestran en su estudio que AGL67 coexpresa con un gran número de genes cuya expresión está regulada positivamente por ABA (inhibidor de la germinación) y negativamente por GAs (promotoras de la germinación). Al igual que sucede con FLC y la regulación de la señalización del ABA (Chiang et al., 2009), la coexpresión entre AGL67 y genes de la señalización de ABA y GAs sugiere que AGL67 pudiera actuar como punto de unión entre las rutas de señalización de ABA y GAs, en el equilibrio que mantienen ambas hormonas para el control del comienzo de la germinación. De este modo, se sabe que mientras mutantes en la enzima GA2-oxidasa, implicada en la inactivación de las GAs, muestran un incremento en los porcentajes de germinación (Yamauchi et al., 2007), mutantes inactivados en los genes CYP707A1 y CYP707A2 muestran un aumento en los niveles de dormición, como consecuencia de un incremento en la acumulación de ABA (Okamoto et al., 2006). En el año 2004, Wang et al. determinaron que el factor de transcripción AGL15 regula directamente la expresión de DOWNSTREAM TARGET OF AGL15-1 (DTA1), un factor de transcripción que codifica un gen con actividad GA-oxidasa y que se expresa al igual que AGL15 durante el desarrollo embrionario. La sobrexpresión del gen DTA1 da lugar a fenotipos propios de mutantes deficientes en GAs. Gran parte de estas características fenotípicas son coincidentes con las descritas en las líneas sobrexpresoras del gen AGL15 (Fernández et al., 2000). Además, la cantidad de GA4 (GA bioactiva) es menor en las plantas sobrexpresoras de DTA1 y AGL15 que en el tipo silvestre. El gen DTA1 presenta un papel en la dormición de semillas. Así, se ha comprobado que el porcentaje de germinación del mutante pérdida de función dta1 es mayor que el del tipo silvestre y que las líneas sobrexpresoras de DTA1 germinan en menor medida. Las semillas carecían de tratamiento frío para evitar favorecer la rotura de la dormición. Por otro lado, el bajo porcentaje de germinación de las líneas sobrexpresoras es rescatado tras la adición de GA4+7. Además, semillas del mutante dta1 tratadas con el inhibidor de la síntesis de GAs paclobutrazol (PAC) germinan en mayor medida que semillas del tipo silvestre. Del mismo modo, se sabe que mutantes con sensibilidad reducida a ABA o con niveles reducidos de la hormona, muestran resistencia a PAC durante la germinación (Koornneef et al., 1998). El uso de otros inhibidores de la síntesis de GAs como el uniconazol en mutantes insensibles a ABA, como abi1-1 o abi3-1, ha evidenciado resultados semejantes, demostrando que este tipo de mutantes requiere menores niveles de GAs para iniciar la germinación (Steber et al., 1998). Los resultados obtenidos en la presente memoria parecen confirmar la hipótesis de que AGL67 pudiera actuar como punto de unión en las rutas de señalización de ABA y GAs. Así, los mutantes de pérdida de función de AGL67 presentan cierto grado de insensibilidad a la adición exógena de ABA y de PAC; mientras las líneas de ganancia de función de AGL67 presentan hipersensibilidad a la adición exógena de PAC, aunque no a la adición exógena de ABA. El cierto grado de insensibilidad de los mutantes de pérdida de función de AGL67 en condiciones de estrés salino (NaCl) y osmótico (Manitol) sugiere que AGL67 pudiera también participar en la ruta de señalización de las respuestas de la planta a estas condiciones de estrés. Numerosos genes implicados en el mantenimiento de la dormición y la ausencia de germinación se expresan también de forma mayoritaria en las respuestas de la planta en condiciones de estrés abiótico (Bassel et al., 2011). Así, Tardif et al. (2007) determinaron que un elevado número de miembros de la familia MADS-box en maíz estaban relacionados con la respuesta a estreses abióticos. En arroz, los genes OsMADS18, OsMADS22, OsMADS26 y OsMADS27 están regulados positivamente por estreses salinos, estrés por frío y estrés por sequía. Mientras que los genes, OsMADS2, OsMADS30 y OsMADS55 se encuentran regulados negativamente por el mismo tipo de estreses (Arora et al., 2007). El gen ZMM7-L de maíz está regulado de modo positivo por estreses abióticos y de forma negativa por ABA. Además, las líneas sobrexpresoras de este gen germinan en menor medida que el tipo silvestre en presencia de cloruro sódico (NaCl) y manitol, sugiriendo el posible papel negativo de ZMM7-L en la respuesta de la planta a estreses abióticos (Zhang et al., 2012). A diferencia de la respuesta frente a la adición exógena de ABA, el fenotipo opuesto que presentan las líneas de pérdida (insensibilidad) y ganancia (hipersensibilidad) de función en presencia de PAC sugiere que los niveles de AGL67 regulan per se la respuesta a la acumulación de las GAs en el proceso de germinación. Así, el aumento de expresión de AGL67 tras la adición de PAC parece indicar que las GAs reprimen la transcripción de AGL67, aunque este resultado no permite excluir una posible regulación adicional a otros niveles. Estos resultados confirman los obtenidos previamente por Cao et al. (2006) tras un exhaustivo análisis transcriptómico en distintos fondos genéticos relacionados con la biosíntesis y señalización de las GAs. Dichos autores mostraron que AGL67 es regulado positivamente por las proteínas DELLA para reprimir el comienzo de la germinación. El análisis transcriptómico de los genes inducidos en el fondo genético del mutante agl67 evidencia que AGL67 actúa reprimiendo la expresión de genes reguladores positivos de la biosíntesis de GAs, como los genes BME3 (Liu et al., 2005) y GASA1 (Aubert et al., 1998). Los niveles de GAs son determinantes para que se produzca la germinación, Así, se ha comprobado que en semillas del tipo silvestre de Arabidopsis, las GAs favorecen la germinación y que el mutante ga1-1, deficiente en la producción de GAs, muestra alteraciones durante esta etapa del desarrollo de la planta (Debeaujon y Koornneef, 2000). Además, el tratamiento con inhibidores de la síntesis de GAs, como PAC y uniconazol, impide la germinación (Nambara et al., 1991, Jacobsen y Olszewsky, 1993). Los genes codificados por la familia de proteínas GASA de Arabidopsis son regulados de modo positivo por GAs. Esta familia de proteínas consta de 14 miembros que actúan en diferentes aspectos del desarrollo de la planta, entre los que se encuentran la germinación de semillas (Roxrud et al., 2007, Rubinovich et al., 2010). Por su parte el factor de transcripción BME3 actúa como regulador positivo de la germinación de semillas, favoreciendo la biosíntesis de GAs activas. En el análisis transcriptómico también aparecen reprimidos genes con actividad hidrolasa, como XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLUCOSYLASE6 (XTR6), XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLUCOSYLASE7 (XTR7), XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLUCOSYLASE17 (XTR17), BETA GLUCOSIDASE4 (BGLU4) y BETA GLUCOSIDASE44 (BGLU44), que actúan como agentes remodeladores de la pared celular en los procesos de elongación asociados a la acción de las GAs (Nonogaki, 2008). En cereales, los genes que codifican enzimas con actividad hidrolasa y que movilizan las sustancias de reserva responden a GAs mediante un motivo en cis conservado llamado GARC. Este motivo es reconocido por factores de transcripción pertenecientes a las familias MYB y DOF. Sin embargo, no parece estar presente en los promotores inducibles por GAs en dicotiledóneas (Ogawa et al., 2003). La activación de genes con actividad hidrolasa durante la germinación de semillas de monocotiledóneas está controlada principalmente por el factor de transcripción GAMYB, inducible por GAs, que reconoce el elemento GARE del complejo GARC presente en los promotores de los genes regulados (Sun y Gubler, 2004). Junto con GAMYB, los factores de transcripción tipo ZINC-FINGER PROTEINS (DOF): STEAROYL DESATURASE (SAD), BPBF, DOF17 y DOF19, son reguladores negativos, excepto SAD que es activador, de esta respuesta, mediante su unión a la caja de pirimidinas presente en el complejo GARC (La Moneda et al., 2003, Mena et al., 2002, Moreno-Risueño et al., 2007). En Arabidopsis, los factores de transcripción tipo DOF, DAG1 y DAG2 son reguladores negativo y positivo, respectivamente, de la germinación (Gualberti et al., 2002). Por otro lado, en la remodelación de la pared celular intervienen, entre otras, un grupo de proteínas conocidas con el nombre de ¿-expansinas. Este tipo de proteínas son codificadas por genes inducibles por GAs. En el mutante deficiente en GAs, gal-3 hay una acumulación aproximadamente 200 veces mayor de EXPANSINA2 tras tratamiento con GAs. En este mismo sentido las ¿-expansinas se localizan en el endospermo, donde tiene lugar un incremento en la biosíntesis de GAs tras estratificación por tratamiento frío (Penfield et al., 2006, Carrera et al., 2008, Linkies et al., 2009, Yamauchi et al., 2004). 2. Relevancia fisiológica de la regulación transcripcional que ejerce AGL67 sobre BME3 en los fenotipos en presencia de PAC. La introducción del transgén BME3GUS en el fondo genético del mutante pérdida de función agl67-1 nos ha permitido confirmar que AGL67 reprime la expresión de BME3 y caracterizarla como independiente de la adición exógena de ABA. Liu et al. (2005) mostraron que los mutantes de pérdida de función en el gen BME3 presentan mayor dormición que el tipo silvestre y que este fenotipo se revierte tras la adición exógena de GAs. En base a estos y otros resultados, los autores concluyeron que el factor de transcripción BME3 actúa como regulador positivo de la germinación de semillas en Arabidopsis, promoviendo la expresión de genes implicados en la biosíntesis de GAs. El fenotipo opuesto que presentan los mutantes de pérdida de función en los genes BME3 y AGL67 en presencia de PAC sugiere que la insensibilidad a PAC en el mutante agl67 se debe a la acumulación del transcrito BME3 en ausencia de su represor. Estudios con el doble mutante agl67bme3 en presencia de PAC permitirán confirmar la relevancia biológica de la regulación transcripcional que ejerce AGL67 en BME3 en los fenotipos en presencia de PAC. Este tipo de estudios han sido utilizados en mutantes de respuesta a ET (ctr1, etr1, ein2, ein3, ein5, ein6 y ein7) (Kieber et al., 1993, Lubarsky et al., 1995). La relación funcional que parece establecerse entre AGL67 y BME3 sugiere la existencia de un circuito de auto-regulación positiva, donde AGL67 reprimiría la expresión de BME3, la ausencia de BME3 disminuiría los niveles de GAs (Liu et al., 2005), y por consiguiente aumentaría la estabilidad de las DELLA, que actuarían como promotores de la expresión de AGL67 (Cao et al., 2006). De acuerdo con esta idea, circuitos de autoregulación positiva se han descrito para otros genes de la familia MADS-box, como SEP3 (Wagner et al., 2009), AGL24 y SOC1 (Liu et al., 2008). En relación con la unión de AGL67al DNA, trabajos pioneros en la década de los 90 permitieron identificar una secuencia consenso (caja CArG) a la que se unen los factores de transcripción de la familia MADS-box, actuando como dímeros (Schwarz-Sommer et al., 1992, Davies et al., 1996). En este sentido, se ha podido determinar que las proteínas, AG, AP1, AP3, PISTILLATA (PI), AGL15, FLC, SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) y SOC1 se unen específicamente a la secuencia CArG o a modificaciones de la misma, dependiendo de la proteína de estudio (Huang et al., 1993, Shiraishi et al., 1993, Riechmann et al., 1996, Hepworth et al., 2002, de Folter y Angenet, 2006, Lee et al., 2007, Lee et al., 2008). Sin embargo, numerosos trabajos evidencian que el nivel de complejidad en el reconocimiento entre el factor de transcripción tipo MADS-box y el DNA es mucho mayor, pudiendo coexistir en un mismo complejo factores de transcripción de otras familias, represores y factores remodeladores de cromatina (Sridhar et al., 2006, Turck et al., 2007, Zhang et al., 2007, Liu et al., 2009, Sun et al., 2009, Smaczniak et al., 2012, Wu et al., 2012). Una secuencia que se ajusta a la secuencia consenso CArG (CTTAAATG) se encuentra de forma única en la región promotora del gen BME3. El ensayo de híbirido sencillo en levadura entre la proteína AGL67 y la secuencia CTTAAATG ha descartado la interacción entre estos dos elementos bajo las condiciones de estudio. La ausencia de interacción sugiere, (1) que AGL67 no regula directamente la expresión de BME3 o (2) la necesidad de la interacción de AGL67 con otras proteínas para mediar la activación de la expresión de BME3. 3. AGL67 está regulado a nivel post-traduccional. Como hemos citado en apartados anteriores, la capacidad de unión de algunos factores de transcripción de la familia MADS-box a la secuencia consenso CArG depende de la formación de dímeros (Schwarz-Sommer et al., 1992, Davies et al., 1996). Así, por ejemplo, en el proceso de formación del polen, los heterodímeros AGL65-AGL104, AGL30-AGL104 y AGL30-AGL66 reconocen secuencias de este tipo en los promotores de determinados genes, regulan su expresión y controlan finalmente la actividad del polen (Verelst et al., 2007, Adamczyk y Fernández, 2009). La composición de los heterodímeros identificados sugiere que existen ciertas reglas en cuanto al tipo de monómeros que los pueden formar: las proteínas homólogas a AGL66, AGL67 y AGL104 (clase S) interaccionan con las proteínas homólogas a AGL30, AGL65 y AGL94 (clase P). En base a las evidencias experimentales no sería posible que las proteínas homodimerizaran o que se formaran heterodímeros de sólo proteínas de clase S o de clase P. En este mismo sentido, estudios de doble híbrido en levadura de los miembros de la familia MADS-box mostraron que la formación de dímeros se producía entre miembros de las mismas subfamilias (Tipo I y tipo II) (Immink et al., 2009). Dentro de las proteínas pertenecientes a la subfamilia tipo I, las interacciones se producen preferentemente entre miembros de las diferentes subclases (de Folter et al., 2005). Así, se ha comprobado que las proteínas M¿ se unen de forma mayoritaria con proteínas tipo Mß y M¿, y que las interacciones entre proteínas M¿ son raras. En este mismo sentido, las interacciones entre proteínas Mß y M¿ son mínimas. Estos resultados sugieren que las proteínas M¿ son las responsables de la estabilización de los complejos (Immink et al., 2009). En Arabidopsis, SEP3 es capaz de interaccionar con SHP1. Sus ortólogos de petunia, FBP2 y FBP6 respectivamente, también interaccionan (Veron et al., 2006). A diferencia de lo publicado por De Folter et al. (2005), que en su estudio masivo de doble híbrido en levadura entre los factores de transcripción de la familia MADS-box no detectan ninguna interacción para AGL67, nuestros resultados de doble híbrido muestran que AGL67 (clase S) no tiene la capacidad de formar homodímeros, pero sí puede formar heterodímeros con AGL65 (clase P) y otros factores de transcripción distintos de la familia MADS-box (TCP16, NFY-C2, TCP10, TCP14, MYB20), que se expresan también en semilla. Mientras que las interacciones entre proteínas tipo MADS-box de mamíferos y levaduras son frecuentes, en plantas las interacciones de miembros de esta familia con otras familias proteícas son raras. Sin embargo, AG es capaz de interaccionar con VEGETATIVE STORAGE PROTEIN1 (VSP1), que presenta actividad fosfatasa ácida y con FLORAL TRANSITION1 (FLOR1), que es una proteína rica en repeticiones de leucina (Gamboa et al., 2001). Por otro lado, la proteína perteneciente a la familia MADS-box de arroz OsMADS18 (Immink et al., 1999) interacciona con la proteína específica de semilla NUCLEAR FACTOR Y SUBUNIT B (NF-YB) (Masiero et al., 2002). Los ensayos de complementación bimolecular fluorescente confirman que la interacción AGL67-AGL65 también se produce en células de tabaco transformadas transitoriamente y que esta interacción se produce en el núcleo. El hecho de que AGL65 se exprese durante la maduración de la silicua (aunque en menor medida que en polen) (Schmid et al., 2005, Toufighi et al., 2005) y que además el mutante de pérdida de función agl65 muestre insensibilidad a PAC, sugieren la posibilidad de que el complejo AGL67-AGL65 tenga una actividad relevante en el inicio de la germinación. El análisis del fenotipo del doble mutante agl67agl65 en presencia de PAC nos aportará más información sobre la importancia de esta interacción. Por otro lado, si la actividad de AGL67-AGL65 conlleva la represión de la expresión de BME3 está por determinar. Estudios de triple híbrido donde coexistan los dos factores de transcripción (AGL67 y AGL65), y la secuencia CTTAAATG, presente en el promotor del gen BME3 en forma única y descrita como secuencia cis de los factores de transcripción de la familia MADS-box (Schwarz-Sommer et al., 1992), nos permitirán confirmar el papel regulador de esta secuencia en la señalización de AGL67. Ensayos de este tipo han mostrado que los dímeros formados entre las proteínas de tipo MADS-box, AG-SEP1 y AG-SEP3, interaccionan con BEL1 regulando el desarrollo del óvulo en Arabidopsis (Bambrilla et al., 2007). Los reguladores transcripcionales ejercen su función en el núcleo, por lo que suelen presentar señales de localización nuclear (NLS) que dirigen su transporte a este orgánulo una vez que ha concluido su traducción en el citoplasma. La familia de factores de transcripción MADS-box contienen en el dominio MADS una zona rica en residuos básicos, que ha sido identificada como una NLS (Gauthier-Rouviere et al., 1995, McGonigle et al., 1996, Immink et al., 2002). El motivo KR(K/R)X4KK, situado entre las posiciones 22 y 30 dentro del dominio MADS, es esencial para el transporte del factor del transcripción al núcleo. La expresión transitoria del transgén AGL67-GFP en hojas de tabaco (mediante agroinfiltración) y en epidermis de cebolla (mediante bombardeo) ha mostrado que la proteína recombinante AGL67-GFP tiene una localización nuclear y extra-nuclear o exclusivamente nuclear, respectivamente. Sin embargo, el estudio de la localización subcelular de la proteína GFP-AGL67 en las plantas sobrexpresoras del gen AGL67, nos indica que la proteína se encuentra en la zona extranuclear de las células estudiadas. Este resultado está de acuerdo a lo publicado previamente por Ito et al., 2011, que mediante sucesivos fraccionamientos y análisis por espectrometría de masas, identifican a AGL67 en la fracción citosólica de muestras provenientes de cultivos celulares de Arabidopsis. La distinta localización de la proteína (núcleo o citosol) en función del sistema en el que se estudie (tabaco, cebolla o Arabidopsis) sugiere la existencia de un posible mecanismo de regulación post-traduccional (además de la transcripción) para el control de la actividad de AGL67. Estos tipos de mecanismos de regulación adicionales, que puede incluir distinta estabilidad de la proteína según el compartimento (Wang et al., 2010), regulación del transporte entre compartimentos (McGonigle et al., 1996, He y Saedler, 2007, Bemer et al., 2008) o transporte intracelular (Perbal et al., 1996, Sieburth et al., 1998, Urbanus et al., 2010), ha sido ya descrito para otras proteínas de la familia MADS-box. Así, por ejemplo, Lee et al. (2008) concluyen que la unión de AGL24 al factor de transcripción SOC1 dirige el complejo al núcleo y activa la expresión del factor de transcripción LFY, regulador clave del desarrollo floral. En este mismo sentido, la formación del heterodímero constituido por los factores de transcripción AP3 y PI, así como el formado por el factor de transcripción UNS, homólogo de SOC1 en petunia, y el factor de transcripción FBP9, perteneciente a la familia MADS-box, , traen consigo una translocación al núcleo (Ferrario et al., 2004, McGonigle et al., 1996). Por otro lado, se ha comprobado que AGL61 es dirigido al núcleo cuando AGL80 está presente (Bemer et al., 2008). En el caso de las proteínas de petunia de tipo MADS-box: FBP2, FBP5, FBP9 y FBP11, implicadas en la formación del óvulo (Angenent et al., 1995), sólamente FBP2, FBP5 y FBP9, capaces de homodimerizar, se encuentran situadas en el núcleo. FBP11, incapaz de homodimerizar, presenta disposición nuclear cuando se coexpresa con otra proteína con la que presenta patrones de interacción (Immink et al., 2002). La hipótesis de que exista una regulación de la actividad AGL67 a través de su localización celular se refuerza al observar que inhibiendo la actividad del proteosoma en Arabidopsis (mediante el compuesto químico MG132) alteramos la localización de la proteína quimérica GFP-AGL67. Así, la localización de la proteína pasa a ser nuclear y extra-nuclear, sin cambios evidentes en su concentración total. El análisis de la localización del la proteínaGFP-AGL67en un fondo genético donde el funcionamiento del proteosoma esté afectado (Ren et al., 2008) nos permitirá confirmar la importancia del proteosoma en el control de la localización celular de AGL67. Teniendo en cuenta que la degradación de las proteínas DELLA es a través de la actividad del proteosoma (Sun et al., 2011) y que las DELLA actúan como reguladores positivos de la expresión de AGL67 (Cao et al., 2006), una posibilidad interesante sería que el cambio de localización observado tras la adición de MG132 pudiera deberse a que las DELLA regularan también el transporte de AGL67 del citosol al núcleo de la célula. El análisis de la localización de la proteína GFP-AGL67en un fondo genético deficiente en GAs con la consiguiente acumulación de proteínas DELLA (ga1-3) nos permitirá confirmar si esta hipótesis es correcta. Los resultados obtenidos en la presente memoria, así como los datos presentes en la bibliografía, nos permiten plantear el siguiente modelo de actuación para explicar el papel de AGL67 como regulador negativo de la germinación de semillas en Arabidopsis (Bassel et al., 2011). De acuerdo a este modelo, la inducción de AGL67 a través de la actividad de las proteínas DELLA (Cao et al., 2006) aumentaría los niveles de AGL67 y reprimiría la expresión del gen BME3. En este complejo represor, AGL67 sería capaz de reclutar cofactores transcripcionales y factores remodeladores de cromatina que podrían influir en la especificidad de unión a BME3 (Smaczniak et al., 2012). La represión de BME3 reduciría los niveles de BME3, conllevaría una disminución en la biosíntesis de GAs activas (Liu et al., 2005) y por consiguiente un aumento en los niveles de proteínas DELLA. De este modo, se cerraría un circuito de auto-regulación positiva para el control de la actividad de AGL67 como represor de la germinación.