Molecular characterization of myelodysplastic syndromes (MDS)analysis of genomic abnormalities in the development of MDS, progression to acute myeloblastic leukemia and response to treatment with 5-azacytidine

Resumen

[ES]Los síndromes mielodisplásicos (SMD) constituyen un conjunto de enfermedades hematológicas clonales que afectan a la célula madre hematopoyética mieloide. Se caracterizan por una gran heterogeneidad clínica y biológica con un elevado riesgo de progresión a leucemia aguda mieloblástica (LAM). Se han identificado una gran variedad de alteraciones genómicas y epigenéticas que resultan en una diferenciación, maduración y crecimiento anómalo de las células hematopoyéticas mieloides, lo que da lugar a un fallo medular y a un mayor riesgo de desarrollar leucemia. Sin embargo, hasta el momento no se ha identificado una única mutación o anomalía genómica que pueda ser responsable del origen y desarrollo de los SMD así como de su frecuente progresión a LAM. Teniendo en cuenta la heterogeneidad molecular de los SMD, las técnicas genómicas de alta resolución (aCGH, SNP-A, PEG, NGS) son herramientas de gran utilidad y mucho más eficaces en el análisis de las anomalías genómicas en los pacientes con SMD. Hasta la fecha son muchos los estudios que se han realizado en los SMD mediante arrays genómicos (aCGH y SNP-A) permitiendo la identificación de alteraciones nuevas y crípticas, no detectadas por las técnicas de citogenética convencional (CC). Los resultados presentados en esta tesis doctoral, así como los datos previamente publicados, han demostrado que existe una muy buena concordancia entre los datos de aCGH y CC, confirmando la fiabilidad de esta técnica para el análisis de grandes anomalías genéticas. Asimismo, los estudios de aCGH han permitido redefinir el pronóstico de algunos pacientes con SMD para las alteraciones ya conocidas como -5/5q-, -7/7q-, trisomía 8, 20q-, y cariotipos complejos. Además, se identificaron alteraciones crípticas (microdeleciones, microamplificaciones) en regiones importantes en la patogénesis de los SMD como deleciones en 2p23.3 (DNMT3A), 4q24 (TET2), 5q33.1 (SPARC), 7q22.1 (CUX1), 21q22.12 (RUNX1) y Xp11.4 (BCOR), y ganancias en 21q22.3 (U2AF1). Las anomalías crípticas han sido fundamentales en el descubrimiento de nuevas mutaciones, como TET2 en los SMD/SMP, CBL en las LMMC, MPL en las ARSA-T, y EZH2 en los MDS, LMMC y LAM. De este modo decidimos analizar si existían mutaciones en el alelo no delecionado en los genes DNMT3A, TET2, TP53, RUNX1 y BCOR aplicando la técnica de secuenciación masiva de amplicones. Nuestros resultados mostraron que una baja proporción de pacientes presentaba una deleción y mutación simultánea en los genes analizados, a excepción de TP53. Por otro lado, el estudio de aCGH identificó la presencia de cromotripsis como un fenómeno novedoso y recurrente, aunque poco frecuente, en tres SMD de alto riesgo, un subtipo de SMD que presenta un alto riesgo de desarrollar una leucemia. En los tres casos afectó exclusivamente al cromosoma 13, con genes como XPO4, FLT1 y FLT3, comúnmente amplificados, y BRCA2 y RB1, como comúnmente delecionados. Los tres casos con cromotripsis presentaron además un cariotipo complejo, mutaciones en TP53 y una supervivencia muy corta, todas ellas características que se han asociado con el fenómeno de cromotripsis. Por lo tanto, los arrays genómicos proporcionan información nueva sobre regiones críticas involucradas en la patogénesis de los SMD. Hay que tener en cuenta que todas las alteraciones citogenéticas, genéticas y epigenéticas pueden afectar a la expresión génica. El análisis de los perfiles de expresión génica (PEG) mediante microarrays ha demostrado ser una herramienta útil en el estudio de los SMD proporcionando una mejor comprensión de los complejos mecanismos que subyacen su patofisiología. Sin embargo, los mecanismos genéticos que podrían determinar la progresión de SMD a LAM son en gran parte desconocidos. Por ello, con el fin de identificar aquellos genes que podrían estar relacionados con la progresión de la enfermedad, nos propusimos analizar los genes y funciones celulares desreguladas en común y de manera progresiva (creciente o decreciente) durante la transición desde una médula ósea no maligna, a través de los SMD de bajo y alto riesgo, hasta las LAM. En base a nuestras observaciones, proponemos un modelo para el desarrollo de los SMD y la progresión hacia la LAM. En este modelo se representa una enfermedad maligna que tiene alteraciones genómicas incluso en las primeras etapas. Durante las fases iniciales, las células mostrarían una reacción frente a un daño en el ADN, que podría estar desencadenada por la desregulación de las proteínas ribosomales, a través de la estabilización y activación de p53. Ante esta situación, las células mostrarían un aumento en los niveles de apoptosis. En este punto, las células todavía conservarían su capacidad de diferenciación/maduración. Sin embargo, el ratio apoptosis/auto-renovación-proliferación en la médula ósea es elevado. Esto reflejaría que las células derivadas a partir del clon maligno inicial no sólo continuarían diferenciándose, sino que también morirían de forma prematura. Al mismo tiempo, debido a un mal funcionamiento de la respuesta inmune se produciría una liberación de citoquinas pro-apoptóticas. Estos mecanismos desregulados darían lugar a una elevada apoptosis intramedular, lo que explicaría, al menos en parte, la hematopoyesis ineficaz y citopenias periféricas observadas en los pacientes con SMD de bajo riesgo. Sin embargo, en estadios más avanzados, ante la acumulación de daño en las células madre hematopoyéticas, las células todavía mostrarían una activación de los mecanismos de respuesta al daño en el ADN, así como una sobre-expresión de las proteínas ribosomales. Además, debido a una maquinaria de reparación deficiente o a un daño excesivo en el ADN, las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras adquirirían y acumularían nuevas alteraciones genéticas y/o epigenéticas. En este punto, las células dañadas mostrarían un aumento en las propiedades proliferativas y de auto-renovación, mientras que no serían capaces de diferenciarse hacia estadios más maduros. Además, estas células mostrarían una resistencia aumentada a la apoptosis, así como una evasión al sistema inmune. En conjunto, estos mecanismos proporcionarían a la célula maligna una cara ventaja proliferativa, y cooperarían permitiendo la expansión del clon maligno. Como resultado, la proporción de blastos en la médula ósea aumentaría a lo largo del tiempo, desarrollándose la leucemia. En conjunto, estos datos sugieren que la progresión de los SMD hacia LAM es un proceso organizado, resultado de la acumulación de daño en el ADN, probablemente debido a que las células madre hematopoyéticas no son capaces de responder adecuadamente a este daño. Nuestro estudio proporciona una base biológica que explicaría muchas de las alteraciones obsevadas en funciones celulares implicadas en la progresión de los SMD a LAM. En los últimos años, se han desarrollado nuevos fármacos para el tratamiento de los SMD y LAM, como los agentes hipometilantes (5-azacitidina y decitabina), que de hecho, se han convertido en el tratamiento de primera línea para estas enfermedades. Sin embargo, y a pesar de la eficacia demostrada de estos fármacos, un 40-50% de los pacientes siguen siendo refractarios. Por esta razón, en el momento actual es de gran interés el poder disponer de factores predictivos de respuesta para seleccionar aquellos pacientes que más se beneficiarían con este tratamiento. Ya que en los SMD y LAM se han descrito un gran número de genes que están hipermetilados, pensamos que el estado de metilación previo al tratamiento podría predecir la respuesta a estos agentes, y seleccionar grupos de enfermos en los que este fármaco pudiera tener mayor o menor eficacia. Sin embargo, nuestro estudio, al igual que otros previamente descritos, demostraron que una metilación aberrante para los genes estudiados no se asociaba con la respuesta a 5-azacitidina. Además, el responder o no a un determinado fármaco, podría alterar el pronóstico de una enfermedad. Por ello, el estudio de la supervivencia en relación con la metilación, en estos pacientes tratados con 5-azacitidina, es también de gran interés para definir el grupo de pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse de este tratamiento. Nuestros datos demostraron que el estado de metilación previo a la 5-azacitidina, en concreto la presencia de ?2 genes metilados, estaba asociada con una supervivencia más corta, siendo menor en el grupo de pacientes con los nivel de metilación más elevados (?3 genes). En resumen, los datos biológicos y moleculares presentados en esta tesis doctoral, en base a los estudios del perfil de expresión génico, de arrays genómicos, secuenciación masiva y metilación, han permitido ampliar nuestro conocimiento sobre la biología de estas hemopatías, mediante la identificación de alteraciones genómicas que podrían tener relevancia clínica. Nuestros datos resaltan la utilidad de las técnicas de análisis masivo en el estudio de los SMD, principalmente en aquellos pacientes con cariotipo normal o pocas metafases analizables. Y además, los genes y mecanismos descritos podrían ser considerados como posibles dianas terapéuticas en el futuro.