Utilización de la Espectrometría de Masas MALDI-TOF en epidemiología bacteriana. Estudio comparativo con técnicas de epidemiología molecular en Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Legionella pneumophila

Resumen

La espectrometría de masas (EM) es una técnica muy usada desde hace años para la identificación de moléculas. Las primeras aplicaciones se dieron a principio de los años 40, en el análisis químico de mezclas de hidrocarburos en la industria del petróleo. Posteriormente, se usó para elucidar compuestos orgánicos, y más tarde para la determinación de estructuras de polipéptidos, proteínas y otros biopolímeros de alto peso molecular. Se fundamenta en la separación de partículas (moleculares o atómicas) por diferencia de masa. El análisis se lleva a cabo en aparatos llamados espectrómetros de masas en cuatro fases: ionización de la muestra, aceleración de los iones por un campo eléctrico, dispersión de iones según su masa y carga, y detección de iones y producción de señal eléctrica. El uso de la EM en la identificación de bacterias está documentado desde 1975 por Anhatt y colaboradores. La primera publicación que demostró el éxito de la EM por desorción-ionización por láser asistida por una matriz (MALDI), fue en los años 80 por Tanaka, Karas y Hillenkamp. El principio fundamental de MALDI-TOF gira en torno a la rapidez de la volatilización de la muestra embebida en una matriz que absorbe la radiación ultravioleta, seguido de un analizador de tiempo de vuelo. Muchos grupos de investigación han señalado su habilidad para obtener un único espectro desde bacterias intactas, y extractos células bacterianas. La reproducibilidad de los espectros se controla mediante la estandarización de condiciones experimentales, ya que autores como Hettick y colabores, han demostrado que los perfiles generados por esta metodología pueden variar significativamente con cambios en la preparación de la muestra. Siendo así, se mantienen invariables la matriz usada, los protocolos de extracción de proteínas y las condiciones de cultivo de bacterias. El uso de perfiles proteómicos mediante la producción de patrones espectrales constituye una buena alternativa los esquemas de identificación basada en la bioquímica o genoma; pudiéndose identificar hasta el momento desde microorganismos gram positivos (Staphylococcus spp, Streptococcus grupo viridans, Listeria spp,…), gram negativos (Neisseria spp, Burkholderia spp,…), micobacterias, hongos levaduriformes, hongos filamentosos, hasta algunos genotipos del virus de la hepatitis C. Una vez expuesta la utilidad para la identificación de microorganismo, y dadas sus amplias ventaja, como alta sensibilidad, precisión, velocidad de adquisición de datos, mínimo coste de consumibles, simplicidad de uso y ahorro de tiempo entre otros. Se plantea ampliar las aplicaciones de EM MALDI-TOF, al estudio de biomarcadores únicos de patógenos como Acinetobacter baumannii, Staphylococcus auresus resistente a meticilina (SAMR), y Legionella pneumophila. En comparación con las técnicas basadas en el análisis del ADN. Dada las características de sencillez, rapidez y reproducibilidad de la EM MALDI-TOF, es posible considerar la posibilidad de su aplicación en la detección de clones y/o líneas clonales entre aislados de la misma especie. Por lo general, la EM MALDI-TOF genera perfiles proteicos relativamente complejos, en los que sólo los picos más característicos y estables a nivel de género o de especie se utilizan para la identificación de los microorganismos. Cabe la posibilidad de que el resto de picos sean no obstante característicos a niveles inferiores al de especie, permitiendo así establecer una categorización de proximidad filogenética entre los aislados paralela a la que se establece ahora por métodos de epidemiología molecular. Este trabajo pretende explorar las posibilidades de desarrollar una herramienta novedosa que, a partir de los datos generado por la EM MALDI-TOF, permita una clasificación filogenética de los microorganismos similar a los métodos de referencia establecidos en epidemiologia molecular (PFGE, MLST y Rep-PCR). Conclusiones: 1. La EM MALDI-TOF demostró ser equiparable a las técnicas establecidas como referencia, PFEG y Rep-PCR, en el estudio de la proximidad entre aislamientos clínicos de Acinetobacter baumannii. 2. Esta agrupación parece además mantenerse de forma bastante robusta con independencia de la metodología estadística y de minería de datos utilizadas, que introducen solamente diferencias menores en la jerarquización. 3. Dadas las discrepancias entre las publicaciones, se imponen estudios más amplios con el fin de determinar la fiabilidad del método a mayor escala, y la posible influencia, no estudiada de los medios, condiciones y tiempos de cultivo en los resultados obtenidos. 4. La jerarquización obtenida en aislamientos de Legionella pneumophila serogrupo 1 se ajusta mucho menos a la jerarquización obtenida por métodos moleculares. 5. Las diferentes estrategias de minería de datos utilizadas alteran sólo moderadamente la jerarquización, que en ningún caso se aproxima a las obtenidas por métodos moleculares. 6. Discrepamos de lo publicado por Fujinami con respecto a la utilidad de esta metodología para la jerarquización de Legionella, al menos con la estrategia de minería de datos usada. Cabe la posibilidad de que otros software diseñados específicamente puedan aproximarse más a la jerarquización molecular. 7. Los datos obtenidos tampoco sugieren que se trate de una metodología útil, en este momento y con el software utilizado, para la jerarquización de S. aureus resistente a meticilina. La clasificación obtenida discrepa sensiblemente de la obtenida mediante MLST con todas las aproximaciones bioinformáticas utilizadas. 8. Se requieren todavía amplios estudios para valorar la posible utilización de esta tecnología para la jerarquización de microorganismos, incidiendo probablemente en una protocolización exhaustiva de medios, tiempos y condiciones de cultivo, así como de la aproximación bioinformática utilizada, que probablemente tendrá que ser diferente para distintos grupos de microorganismos.