Funciones fisiológicas de la detoxificación del óxido nítrico en Fusarium oxysporum f. sp. phaseoliEl papel de las flavohemoglobinas Eduardo Enrique Argotti Valencia 2016

  1. Argotti Valencia, Eduardo Enrique
Supervised by:
  1. José María Díaz Mínguez Director
  2. Ernesto Pérez Benito Director

Defence university: Universidad de Salamanca

Fecha de defensa: 19 May 2016

Committee:
  1. Francisco Javier Ávalos Cordero Chair
  2. Luis Sanz Andreu Secretary
  3. María Teresa González Jaén Committee member
Department:
  1. MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA

Type: Thesis

Abstract

Entre los factores bióticos que determinan mayores pérdidas económicas en los cultivos agrícolas se encuentran los hongos fitopatógenos. F. oxysporum constituye un complejo de especies con una considerable variación morfológica y fisiológica, cuyos individuos pueden crecer y multiplicarse como saprófitos sobre materia orgánica o bien colonizando plantas. El colectivo de estirpes patógenas puede infectar más de 100 especies vegetales distintas, e incluso hospedadores animales como el hombre. Individualmente, este abanico de posibilidades de infección se restringe a una especie o unas pocas especies del mismo género, lo cual permite la clasificación de las distintas estirpes de F. oxysporum en formas especiales que poseen una rango de infección muy estrecho. En particular, F. oxysporum f. sp. phaseoli, el objeto de estudio del presente trabajo, infecta y coloniza unas pocas especies del género Phaseolus, y, típicamente, P. vulgaris, provocando la marchitez vascular de la judía. Esta enfermedad presenta una incidencia notable en todas las regiones del mundo en las que se cultivan judías. Los procesos de infección y colonización de las plantas atacadas son muy parecidos en todas las formas especiales de F. oxysporum. El hongo, habitual en los suelos, es capaz de penetrar las raíces del vegetal, especialmente a través de heridas o de las discontinuidades entre las raíces laterales y la raíz principal. Una vez dentro del tejido cortical avanza hacia el cilindro central radicular para diseminarse a continuación por los haces vasculares de la planta. La colonización de los haces xilemáticos del huésped provoca la obstrucción de los mismos y la reducción del aporte de agua y nutrientes a las partes aéreas de la planta, dando lugar a la marchitez característica de las infecciones causadas por F. oxysporum, lo cual finaliza en muchas ocasiones con la muerte de la planta. El tipo de colonización eminentemente vascular característico de F. oxysporum no permite una fácil adscripción a cualquiera de las categorías de patógenos descritas, esto es, biotrofos, hemibiotrofos y necrotrofos. En ocasiones se considera su estilo de vida infeccioso como hemibiotrófico. La primera parte de su ciclo colonizador podría considerarse biotrófica; sin embargo, no está claro que en una segunda etapa degrade y destruya activamente los tejidos de la planta, como para considerarla típicamente necrotrófica. La agresión por organismos patógenos desencadena en las plantas infectadas una compleja respuesta de defensa. Entre los mecanismos que participan en la misma destacan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de óxido nítrico (NO), moléculas muy reactivas, con un papel señalizador fundamental y que orquestan y coordinan los procesos que participan en la respuesta defensiva, en particular en la activación de la respuesta de hipersensibilidad (HR). El NO, en particular, resulta muy importante por la multiplicidad de papeles que desempeña. Desde el punto de vista de la respuesta defensiva vegetal, juega un doble papel: por una parte resulta esencial en la activación del programa de muerte celular programada que conduce a la muerte de las células que entran en contacto con el patógeno y, por otra, presenta una elevada toxicidad sobre la mayor parte de los microorganismos patógenos. Además, el NO tiene una intervención destacada en procesos de diferenciación y desarrollo en los organismos, incluídos los propios patógenos, lo cual implica que la modulación de su concentración necesariamente esté sometida a una estricta regulación. Teniendo en cuenta que el NO es un gas que se difunde con suma facilidad y que la modulación de su concentración implica tanto al NO exógeno, producido por la planta infectada como parte de su respuesta defensiva, como al endógeno, producido por los procesos metabólicos del patógeno, resulta imprescindible el concurso de mecanismos de detoxificación. Las enzimas de tipo flavohemoglobina son enzimas con actividad dioxigenasa de NO dependiente de NADPH, FAD y O2, que detoxifican NO produciendo nitrato. Estas enzimas están presentes únicamente en hongos y bacterias, no habiendo sido descritas ni en sistemas animales ni en plantas. En los distintos microorganismos en los que la actividad y la función de estas enzimas han sido investigadas se ha comprobado que son codificadas por genes de copia única o por pequeñas familias génicas y que confieren protección frente a condiciones de estrés nitrosativo. En modelos de patógenos animales las flavohemoglobinas son unos poderosos agentes detoxificadores de NO con un claro efecto en virulencia. En Cryptococcus neoformans, un patógeno humano, la enzima flavohemoglobina protege al hongo del daño nitrosativo producido por el NO liberado por los macrófagos. En el caso del Erwinia chrisanthemi, patógeno vegetal de naturaleza biotrofa, la enzima flavohemoglobina resulta esencial para que el patógeno pueda infectar a su planta huésped. Debido a la importancia biológica de las proteínas tipo flavohemoglobina en el metabolismo del NO, el objetivo de nuestro trabajo de investigación fue determinar el papel de las proteínas flavohemoglobinas en F. oxysporum. Mediante análisis bioinformático e hibridación tipo Southern se han identificado en este hongo fitopatógeno cuatro genes codificadores de enzimas tipo flavohemoglobina (FHG), siendo el organismo eucariota con más copias de genes FHG descritos hasta el momento. Los cuatro genes carecen de intrones y son de copia única. Las proteínas correspondientes, denominadas FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4, presentan los tres dominios funcionales de una proteína tipo flavohemoglobina. FHG1, FHG2 y FHG3 tienen localización citoplasmática, mientras que FHG4 posee una secuencia señal de localización mitocondrial. El análisis filogenético agrupa a las proteínas FHG1, FHG2 y FHG3 en un clado que incluye a la mayor parte de las flavohemoglobinas de hongos, incluidas las dos o tres flavohemoglobinas descritas en otras especies del género Fusarium. La flavohemoglobina FHG4 se ubica en un clado diferente junto a proteínas FHG de especies del género Aspergillus, proteínas de localización mitocondrial que están más relacionadas con las flavohemoglobinas de bacterias desnitrificantes. Los patrones de expresión de los genes FHG de F. oxysporum son indicativos de la existencia de mecanismos de regulación de la expresión en respuesta a distintos estímulos: desarrollo, fuente de nitrógeno y exposición a NO. Los genes FHG1, FHG2 y FHG3 responden transcripcionalmente a NO exógeno. Esta inducción de la transcripción por exposición a NO es una respuesta esperada para genes que codifican componentes esenciales de mecanismos de detoxificación de NO. No obstante, cada uno de ellos muestra un patrón de expresión específico y diferencial. Cuantitativamente la respuesta de FHG1 a NO es la más intensa, sólo se produce en la fase de germinación de los microconidios y no está sometida a represión metabólica por presencia de amonio en el medio de cultivo. FHG1 no se expresa en la fase de desarrollo del micelio, ni en ausencia ni en presencia de NO. FHG2 también responde transcripcionalmente a NO y solo lo hace de forma clara en la fase de germinación de los microconidios, fase en la que la presencia de amonio tampoco bloquea la inducción de la expresión en respuesta a NO. Cabe pensar que ambos genes están implicados, en este estadio de desarrollo, en un mecanismo de defensa inducible en respuesta a NO, el cual es independiente de la presencia de amonio, y que las enzimas codificadas participan en la detoxificación del NO al que las esporas del hongo son expuestas. En la fase de crecimiento FHG2 muestra un patrón de expresión diferente, con niveles máximos en medio mínimo con glucosa y en ausencia de fuente de nitrógeno. Durante esta fase la expresión de FHG2 está reprimida en presencia de amonio. Sorprendentemente, esta represión se mantiene aún en presencia de NO. Es decir, en la fase de micelio, FHG2 muestra respuestas transcripcionales que sugieren que participa en procesos específicos de esta etapa de desarrollo, probablemente más relacionadas con el metabolismo del nitrógeno en general que con una respuesta específica de defensa frente a NO. FHG3 muestra un patrón de expresión similar en esporas y en micelio y con una respuesta a la exposición a NO muy limitada. Sí muestra una respuesta a amonio, cuya presencia estimula su expresión durante la germinación de las esporas, estimulación que no se observa en los genes FHG1 y FHG2. Por lo tanto, FHG3 también muestra respuestas que sugieren una posible participación en metabolismo del nitrógeno en general, no específicamente en detoxificación de NO. Sin embargo, la respuesta observada no deriva de una posible represión metabólica por presencia de amonio sino, más bien al contrario, de estimulación de la expresión en presencia de esta fuente de nitrógeno. FHG4 no se expresa a niveles detectables en ninguna de las condiciones consideradas. Teniendo en cuenta que todas estas condiciones son aerobias y dada la presencia de señales de localización mitocondrial en la proteína deducida, es posible proponer que FHG4 participa en procesos relacionados con desnitrificación y con eliminación de NO específicos del metabolismo mitocondrial. Estas variadas respuestas transcripcionales sugieren que la disponibilidad de cuatro genes FHG puede proporcionar a F. oxysporum una notable versatilidad metabólica en la utilización de fuentes de nitrógeno, la cual puede resultar útil en determinadas condiciones ambientales. Se ha comprobado que las cepas FOP-SP1 y FOP-SP4 son sensibles a NO y que la exposición a NO exógeno determina una reducción moderada en la eficiencia de germinación de microconidios en ambas cepas, lo que supone que éste altera o modula la actividad de componentes esenciales para que se produzca la germinación de los microconidios. Esta sensibilidad es superior en la estirpe poco patógena FOP-SP4 que en la muy patógena FOP-SP1. Utilizando el método de transformación mediada por A. tumefaciens (ATM) se han obtenido mutantes nulos en los genes FHG en ambas cepas del patógeno. La evaluación del comportamiento de los distintos mutantes en condiciones de estrés nitrosativo en medios con amonio o nitrato indica que los mutantes ∆FHG1 y ∆FHG2 son hipersensibles a NO, resultados que demuestran que las flavohemoglobinas FHG1 y FHG2 juegan un papel importante en la detoxificación de NO en F. oxysporum y que son las responsables de mantener la concentración de NO en el interior de la célula dentro de unos niveles compatibles con el normal funcionamiento del metabolismo celular. Los mutantes ∆FHG1 muestran una mayor sensibilidad a NO exógeno que los mutantes ∆FHG2, lo que indica que FHG1 tiene una contribución más relevante en la detoxificación de NO exógeno que FHG2. Los mutantes ∆FHG3 y ∆FHG4 no muestran hipersensibilidad a NO en las condiciones evaluadas, lo que sugiere que FHG3 y FHG4 no desempeñan un papel importante en la detoxificación de NO exógeno. La caracterización fisiológica de los mutantes ∆FHG demuestra que en la eliminación de los niveles de NO que afectan a los componentes de la maquinaria celular implicada en el programa de germinación juega un papel fundamental la enzima FHG1, ya que en los mutantes ΔFHG1 lo que en realidad se produce es un bloqueo de la germinación, no un retraso. Este bloqueo se observa en las dos cepas de F. oxysporum y en presencia de una u otra fuente de nitrógeno. El hecho de que este bloqueo se produzca en cepas que poseen alelos de tipo silvestre para los otros tres genes FHG supone que FHG1 es responsable específicamente de eliminar el NO que afecta a estos componentes esenciales de la maquinaria de germinación y que su función no es asumida, o compensada, ni siguiera parcialmente, por alguna de las otras tres enzimas FHG de F. oxysporum. En medios de cultivo con nitrato, pero no con amonio, la exposición a NO sí determina una reducción en la eficiencia de germinación de los mutantes ∆FHG2, si bien de menor magnitud que la observada en los mutantes ∆FHG1. Una hipótesis que explica estos resultados consiste en que FHG2 es responsable de detoxificar NO que afecta a la germinación, NO que no puede detoxificar FHG1 y que tiene que ver con el metabolismo del nitrato en los mutantes ∆FHG2. Por su parte, el análisis de los mutantes correspondientes demuestra que las flavohemoglobinas FHG3 y FHG4 no juegan un papel importante en la eliminación del NO que afecta a la germinación de los microconidios en FOP-SP1 y en FOP-SP4. La mayor sensibilidad que las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 muestran frente a NO exógeno encaja con un papel activo de esta molécula en la respuesta defensiva de la judía frente a F. oxysporum f. sp. phaseoli. Si es así, la pérdida de la capacidad para detoxificar NO por parte de los mutantes ∆FHG1 y ∆FHG2 debería suponer una disminución de la capacidad de los mismos para eliminar el NO que la planta huésped produce durante el establecimiento y progreso de la interacción. Cabría esperar entonces una disminución en la agresividad de las cepas mutantes ∆FHG sobre su huésped. Sin embargo, se ha comprobado que la deleción de los genes FHG no altera la capacidad de infección de las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4. Por lo tanto, asumimos que los genes FHG no tienen un efecto destacable en la patogenicidad de F. oxysporum y concluimos que las enzimas FHG no pueden ser consideradas como factores de virulencia en este hongo fitopatógeno. El hecho de que los mutantes muestren el mismo comportamiento que las cepas de tipo silvestre durante la interacción nos lleva a considerar que, o bien los niveles de NO producidos durante la interacción con el huésped no son lo suficientemente elevados como para limitar el progreso del patógeno o bien F. oxysporum dispone de otros sistemas de detoxificación de NO. Ciertamente las enzimas FHG de F. oxysporum no parecen jugar un papel esencial en el establecimiento de la interacción entre el patógeno y su huésped. La consideración de la existencia de varias copias de genes codificadores de FHG, de la regulación diferencial de la expresión de unos y otros en respuesta a distintos estímulos, entre ellos la fase de desarrollo, la fuente de nitrógeno y la exposición a NO, y de la información derivada de la caracterización fisiológica de los mutantes alterados en la producción de flavohemoglobinas, permiten relacionar la función de estas enzimas más bien con procesos metabólicos básicos, esencialmente procesos relacionados con el metabolismo del nitrógeno, que condicionan a su vez procesos de desarrollo esenciales, como la germinación de los microconidios. La disponibilidad de varias enzimas FHG puede conferir ventajas adaptativas en condiciones ambientales y de acceso a nutrientes muy diversas, contribuyendo a proporcionar a F. oxysporum una versatilidad metabólica muy notable.