Caracterización Inmunofenotópica del sistema inmune en pacientes con vitíligo y/o halo nevus

Resumen

Los melanocitos son células derivadas de la cresta neural, que migran hacia epidermis, localizándose justo encima de la memabrana basal. Su principal función es la síntesis de melanina, responsable del color de la piel, que es transferida a través de sus prolongaciones dendríticas, a los queratinocitos adyacentes, con los que conforma una unidad funcional. Los melanocitos pueden encontrarse agrupados formando neoplasias benignas conocidas como nevus melanocíticos. Los nevus melanocíticos, y por ende los propios melanocitos, tienen una elevada capacidad de estimular el sistema inmune, lo que se pone de manifiesto con el desarrollo de multitud de procesos inflamatorios que suelen acontecer alrededor de ellos. Entre estas dermatosis, la más representativa es el halo nevus o nevus de Sutton, pero existen otras muchas como el nevus targetoide, el nevus de Meyerson (halo-dermatitis), la psoriasis perinévica, o el eritema exudativo multiforme perinévico; y en todas ellas subyace un fenómeno inmunológico asociado. Un halo nevus o nevus de Sutton, es un nevus melanocítico rodeado de un área circular periférica de despigmentación, que puede terminar con la regresión espontánea y completa del mismo. Está presente en más del 1% de la población, especialmente en niños y adolescentes, sin existir diferencias entre géneros. Los pacientes suelen tener antecedentes familiares de halo nevus o vitíligo. Así mismo, los pacientes con vitíligo tienen una frecuencia elevada de halo nevus. Mientras que algunos autores consideran que la presencia de halo nevus podría ser un factor de riesgo para el desarrollo de vitíligo, incluso podría tratarse de un signo clínico de vitíligo, otros consideran un mecanismo de producción inicial diferente. Así pues, aunque el suceso final en ambos casos es la destrución de melanocitos, el desencadenanate inicial puede ser diferente en cada uno de ellos ( melanocitos del propio nevus o nevocitos frente a mlanocitos epidérmicos), y sólo en un subgrupo de pacientes, la aparición de halo nevus podría ser un factor iniciador en la patogénesis del vitíligo, aquellos con mayor susceptibilidad genética para el desarrollo de enfermedades autoinmunes, incluyendo el propio vitíligo. El vitíligo es un trastorno adquirido de la pigmentación cutánea y mucosa, caracterizado por la presencia de áreas despigmentadas, secundarias a la perdida crónica y progresiva de los melanocitos epidérmicos. Tiene una prevalencia estimada de 1% de la población en Estados Unidos y Europa, aunque los rangos van desde menos del 0.1 a más del 8% a nivel mundial, no habiendo diferencias según fototipo o raza. A pesar de que las mujeres suelen solicitar tratamiento con mayor frecuencia, parece afectar por igual a hombres y mujeres, si bien en ellas de forma más temprana. En la mitad de los pacientes debuta antes de los 20 años, pudiendo aparecer a edades más tardías o avanzadas, lo que nos debe hacer sospechar otras enfermedades asociadas. El curso de la enfermedad es impredecible y puede mantenerse estacionaria, puede repigmentarse espontáneamente o tras un tratamiento específico, o bien avanzar progresivamente abarcando áreas extensas de la piel, lo que suele conllevar cierta estigmatización social con consecuencias psicológicas y disminución la calidad de vida de los pacientes. En este sentido, la determinación del impacto sobre la calidad de vida medido según la escala DLQI (Dermatolgy Life Quality Index) determina un rango de puntuación del 4.82 al 14.72, siendo en algunos aspectos como relaciones sociales, ocio o forma de vestir, más elevados que en otras enfermedades con conocida repercusión sobre la calidad de vida como es la psoriasis. Pese a las diferentes estrategias terapéuticas disponibles en la actualidad, el vitíligo sigue siendo incurable. La enfermedad suele reconocerse por la aparición de máculas o manchas hipopigmentadas o acrómicas, es decir blancas, en la piel y las mucosas. Estas manchas se observan más frecuentemente en zonas de fricción o que están sometidas a traumatismos, áreas normalmente más pigmentadas como las regiones periorificiales de la cara, anogenitales o areolares, y suelen hacerse más evidentes en zonas expuestas al sol como son la cara o dorso de las manos. Así, según su forma clínica, el vitíligo puede clasificarse como: 1) vitíligo propiamente dicho o vitíligo no segmentario (VNS), que se caracteriza por una distribución multifocal y simétrica de las áreas hipopigmentadas, pudiendo presentar una afectación acrofacial, generalizada (con o sin implicación acrofacial), universal (con un 80-90% de superficie corporal afectada) y mucosa (con más de una mucosa afectada, habitualmente de distribución oro-genital); 2) vitíligo segmentario (VS), que se caracteriza porque las máculas o manchas se distribuyen de forma limitada, unilateral y normalmente respetando la linea media; 3) vitíligo mixto, que presenta afectación segmentaria y no segmentaria de forma combinada; y 4) vitíligo indeterminado en el que aparecen máculas aisladas y reducidas en tamaño en cualquier localización, pudiendo tratarse de una forma cutánea focal o mucosa pura. Estás formas pueden evolucionar hacia un vitíligo segmentario o no segmentario, o bien permanecer inclasificables. Aunque debido a su naturaleza cutánea, la enfermedad se conozca desde hace siglos, la causa por la que desaparecen los melanocitos no se conoce con exactitud. Se han formulado diferentes teorías sobre su etipoatogenia, atribuyéndolo principalmente a causas genéticas, autotóxicas, neurohumorales y destacando principalmente la que considera a esta enfermedad de origen autoinmune. En este sentido, hasta en un 30% de los pacientes puede asociarse a otro tipo de enfermedades autoinmunes como la diabetes, la anemia perniciosa, la enfermedad de Addison, la enfermedad inflamatoria intestinal, la psoriasis, el lupus eritematoso y especialmente las enfermedades tiroideas. Asimismo, la mayoría de los tratamientos utilizados, especialmente corticoides, inhibidores de la calcineurina o y/o fototerapia, tienen un conocido efecto inmunosupresor. Se ha observado que situaciones como el estrés o los traumatismos (fenómeno de Koebner) pueden precipitar la aparición de estas lesiones en pacientes predispuestos. Por tanto, parece ser que en pacientes genéticamente susceptibles, factores como la autoinmunidad, infecciones, estrés, traumatismos, anormalidades neurológicas, o factores tóxicos, podrían tener un rol patogénico. Las diferencias en la forma de presentación, evolución y enfermedades asociadas entre el VNS y VS, determinaron inicialmente su clasificación como entidades completamente separadas. Sin embrago, hoy día se consideran distintos polos del mismo espectro de enfermedad, existiendo un solapamiento entra ambas formas clínicas. Las diferentes teorías etiopatogénicas del VS no son excluyentes entre sí, y en ellas subyace una causa autoinmune, según la cual, posiblemente una reacción transitoria autoinflamatoria podría iniciar el daño en el melanocito, y la predisposición genética individual a desarrollar enfermedades autoinmunes, determinaría el grado de afectación entre VS y VNS. Así pues, el VS actuaría como desencadenante de una respuesta inmune antimelanocito, permitiendo en algunos casos el desarrollo de un vitíligo generalizado posterior. Los principlales factores que se asocian a un mayor riesgo de progresión del VS a formas mixtas son la presencia de halo nevus, fenómeno de Koebner y leucotriquia, lo que podría representar una afectación más difusa de los melanocitos dañados; así como la localización inicial del segmento afectado en el tronco. Así pues, una vez tenidas en cuenta estás consideraciones, la trascendencia socio-económica del vitíligo asociada a su etiopatogenia aún desconocida pero probablemente multifactorial, representan los pilares del presente estudio. El hecho de un probable origen autoinmune unido a determinadas características genéticas, hace que las nuevas herramientas inmunofenotípicas resulten muy atractivas para el estudio de la enfermedad. En relación con el proceso autoinmune, se especula que tanto la respuesta inmune innata como adaptativa tienen una participación directa. Varios probables desencadenantes locales, entre ellos un traumatismo, pueden alertar el sistema inmune innato, que precede a la respuesta adaptativa específica frente a los melanocitos. La rama humoral se caracterizaría por la presencia de anticuerpos contra múltiples antígenos expresados en los melanocitos, mientras que la rama celular se debe a la expansión de linfocitos T CD8 autorreactivos. Una disfunción en los linfocitos T reguladores, ya observada en otras enfermedades autoinmunes, facilitaría el desarrollo de estos clones de linfocitos T y anticuerpos dirigidos frente a los melanocitos. La respuesta innata aumenta a su vez el reclutamiento de linfocitos T CD8 (citotóxicos) y macrófagos. Posiblemente, la destrución inicial de los melanocitos sería consecuencia de la acumulación de metabolitos tóxicos y posterior amplificación autoinmune del daño sobre estos. En base a los estudios genómicos, el vitíligo generalizado se considera un trastorno poligénico y multifactorial, que implica numerosos genes, la mayoría de ellos que codifican proteínas que regulan el reconocimiento o destrucción de los melanocitos por el sitema inmune. Algunos de estos genes determinarían una mayor susceptibilidad general para el desarrollo de enfermedades autoinmunes, mientras que otros determinarían una autoinmunidad específica frente a los melanocitos. Recientemente, se han identificado 16 loci relacionados con vitíligo generalizado, que representan sólo el 10% del riesgo genético para desarrollar la enfermedad, lo que pone de manifiesto que otros loci adicionales están probablemente por descubrir. Cabe destacar que 15 de esas 16 mutaciones se encuentran en genes relacionados con la regulación del sistema inmune o autoinmunidad. Nuestra hipótesis se basa en la posibilidad de correlacionar los hallazgos inmunofenotípicos en sangre periférica con variantes clínicas específicas de la enfermedad (vitíligo, halo nevus y vitíligo asociado a halo nevus), lo que podría contribuir al conocimiento de su patogenia y al diseño de nuevas estrategias terapéuticas. El objetivo prinipal de este trabajo de Tesis Doctoral es una caracterización exhaustiva del sistema inmunitario periférico de un total de 43 pacientes con vitíligo y/o halo nevus a nivel inmunofenotípico (mediante citometría de flujo multidimensional). Los resultados biológicos obtenidos se asociarán con las características clínicas de la enfermedad y su posible relación con otros factores (enfermedades autoinmunes, infecciones, estrés, traumatismos o afectación neurológica), pretendiendo con ello una caracterización completa, clínico-biológica, de la enfermedad (investigación traslacional). Para ello, hemos aplicado los recientes avances tecnológicos desarrollados para el análisis inmunofenotípico mediante citometría de flujo en el campo de la Hematología (utilizados en diagnóstico diferencial y monitorización de enfermedad mínima residual de leucemias y linfomas) al campo de la Inmunología. Hemos estudiado en detalle la frecuencia y el perfil fenotípico de las poblaciones celulares más relevantes del sistema inmune (células T, B, dendríticas, NK, y mieloides). Los estudios inmunofenotípicos se llevaron a cabo en muestras de sangre periférica durante las primeras 4-6 horas tras su extracción. Se emplearon técnicas de inmunofluorescencia directa de alta resolución (8-colores) y alta sensibilidad (más de 1 millón de células analizadas), mediante marcajes óctuples con los siguientes anticuerpos monoclonales: PacB / PacO / FITC / PE / PerCP-Cy5.5 / PECy7 / APC / APCH7. El panel de anticuerpos monoclonales permitió la identificación de células T (CD3), colaboradoras (CD4) y citotóxicas (CD8), además de otros compartimentos minoritarios como células T reguladoras CD4 y CD8 (CD25++ / CD127+dim), con potencial de circulación por piel (CLA+) y células T gamma-delta (TCRgd+). Se estudió en detalle la maduración periférica de células T CD4 y CD8 con la identificación de los compartimentos naive (CD45RA+ / CD27+), memoria central (CD45RA- / CD27+), memoria efectora (CD45RA- / CD27-), y efector (CD45RA+ / CD27-). Además, se evaluó la expresión en células T de marcadores de activación (CD25 o HLA-DR), inhibición (PD1), o asociados a citotoxicidad (CD16+ y/o CD56+)). Por otro lado, y debida a la potencial implicación de producción de anticuerpos frente a los melanocitos, estudiamos en detalle las células B (CD19) en sangre periférica, identificando los compartimentos de células B inmaduras (CD10+ / CD38+), naive (sIgM+ / CD27-), de memoria (CD27+), y plasmablastos (CD27++ /CD38++). Además, evaluamos en detalle la distribución de células B de memoria y plasmoblastos para las inmuglobulinas IgM, IgG, e IgA de superficie. También fue posible la identificación de las células dendríticas plasmocitoides (CD123+ HLA-DR+), mieloides (HLA-DR+ / CD33+ / CD14-), células natural-killer (CD16+ / CD3-) con sus subpolaciones (CD56++ y CD56+) y formas activadas (HLA-DR+), monocitos (CD33++ / HLA-DR+), con sus tres poblaciones: "clasicos" (CD14++CD16-), "intermedios" (CD14++CD16+), y "no clásicos" (CD14-CD16+dim), basófilos (CD123+ / HLA-DR-), eosinófilos (SSc/AF) y granulocitos (CD16+ / CD14- / SSChi). Finalmente, en base a las características antigénicas se realizó una separación celular mediante citometría de flujo de subpoblaciones celulares potencialmente involucradas en la patogénesis del vitíligo y/o halo nevus, para realizar específicamente sobre ellas estudios genómicos y de perfil de expresión de RNAm, cuando se disponga de los fondos necesarios. Asimismo, se congelaron y almacenaron sueros para la cuantificación de citoquinas, cuando se disponga de dichos fondos,