Analisis funcional de celulasa celc2 en la interacción mutualista de rhizobium en cereales, leguminosas y solanáceas

Zusammenfassung

De acuerdo con los datos de la FAO, las necesidades alimentarias de la población para 2050 podrían incrementarse un 70% respecto a las actuales, siendo un verdadero reto el crecimiento de la demanda energética y producción agraria. Estudios realizados en todo el mundo han demostrado que los rhizobia además de comportarse como endosimbiontes en leguminosas también tienen la capacidad de formar asociaciones endofíticas con diversos cereales generando la promoción del crecimiento vegetativo, incluyendo el rendimiento de grano (Dazzo et al. 2005). Según los trabajos realizados en nuestro laboratorio se comprobo que la celulasa (CelC2) producidas por el microsimbionte R. leguminosarum bv. trifolii ANU843 puede hidrolizar de una forma muy localizada y específica la pared celular de su planta homóloga Trifolium repens evitando la destrucción de la misma y facilitando la entrada de la bacteria (Robledo et al. 2008). Nuestro grupo de investigación en colaboración con otros grupos internacionales aislamos varias cepas de Rhizobium, rizoendosimbiontes del trébol y endofitos del arroz (Yanni et al. 1997). En base a los antecedentes y como continuación de este trabajo se selecciono la cepa E11 y se desarrollo la tesis doctoral. La cual se organizó en 5 capítulos. Capítulo I: Caracterización de la cepa E11 y sus mutantes en el gen celC. Se realizó la caracterización genética y taxonómica de la cepa E11 mediante la secuenciación del gen 16S y genes housekeeping recA, atpD y el gen celC. Los resultados obtenidos según los análisis filogenéticos basados en genes estables localizados en el cromosoma clasificaron a esta cepa como R. leguminosarum. Sin embargo, se deben realizar estudios adicionales como hibridación ADN- ADN y pruebas fenotípicas para poder hacer una identificación más exacta de biovariedad, así como incluir genes relacionados con la formación de nódulos, ya que son buenos marcadores de la coevolución de los rhizobia con su hospedador. Por tanto, y de momento la cepa E11 seguirá siendo denominada Rhizobium leguminosarum. La cepa de trabajo R. leguminosarum E11, contiene el gen celC localizado en una región del cromosoma formando parte del operón implicado en la biosíntesis de celulosa celABC. Este gen codifica para una celulasa homóloga a la CelC2 de R. leguminsarum ANU843. CapítuloII: Implicación de la celulasa CelC2 en la biosíntesis de celulosa, formación de biofilms y diálogo molecular (Quorum sensing). Se evalúo la implicación del gen celC en el fenotipo de la cepa silvestre E11 y los mutantes del gen celC, E11¿C2 y E11C2+. Este gen desempeña un papel importante en la biosíntesis de celulosa bacteriana, modulando la longitud de las microfibrillas externas de celulosa. Además, se evaluó la implicación del gen celC en la síntesis y producción de exopolisacárido insoluble; al igual que se analizó la importancia de la producción de la matriz exopolisacarídica (celulosa) en la formación de biofilms y en el diálogo molecular (Quorum sensing). Nuestros resultados indican que las microfibrillas de celulosa intervienen en la adhesión y formación de biofilms por parte de las bacterias tanto en la raíz de la planta como en superficies abióticas, y el incremento o la disminución en la producción de microfibrillas externas de celulosa afecta severamente la capacidad de adhesión y formación de biofilms de las células bacterianas a superficies bióticas y abióticas. Al igual que acelera o retarda respectivamente la activación de las moléculas señal de quorum sensing. Capítulo III: implicación del nitrógeno en el Fenotipo Simbiótico en Trifolium repens. Se compararon los fenotipos simbióticos de la cepa silvestre E11 y de los mutantes E11¿C2 y E11C2+ mediante ensayos de infectividad y nodulación y se analizó la implicación de la actividad de la celulasa CelC2 en el proceso de infección de Rhizobium leguminosarum E11 en trébol. Además se evaluó la implicación del Nitrógeno en el fenotipo simbiótico Rhizobium-leguminosa, observándose que la presencia de Nitrógeno bloquea la infección intracelular de Rhizobium en trébol, a través de la punta de los pelos radicales; no viéndose afectada la inducción de nódulos. Sin embargo, la cepa mutante E11C2+ incrementa su infectividad debido a una mayor capacidad de penetrar en la planta a través de espacios intercelulares. Por otro lado y según los resultdos obtenidos con el mutante E11¿C2 comprobamos que la celulasa CelC2 no es indispensable para la invasión a través de espacios intercelulares o grietas en su planta homóloga Trifolium repens, aunque un incremento de esta enzima favorezca esta via de infección. Capítulo IV: Uso de Rhizobium como alternativa para la mejora de la producción vegetal en los cultivos de arroz. Se analizó la influencia de la celulasa CelC2 producida por Rhizobium en el proceso de colonización e infección de plantas no leguminosas (Arroz) y se estableció la capacidad de la cepa Rhizobium leguminosarum E11 y los mutantes del gen celC, de infectar las raíces de arroz, determinando en qué grado esta asociación endofítica promueve el crecimiento vegetal. Observando así, que existe una influencia positiva con la combinación de distintos fertilizantes nitrogenados y los biofertilizantes R. leguminosarum E11 y E11C2+, en la PGPR y rendimiento de la producción bajo condiciones controladas en invernadero. Capítulo V: Rhizobium; eficiencia y efectividad, en la promoción del crecimiento vegetal y productividad en Tomate. Se estudio la influencia de la celulasa CelC2 en el proceso de colonización e infección de plantas no leguminosas (Tomate), evaluando la capacidad de la cepa E11 y los mutantes del gen celC, de infectar las raíces de tomate, y determinar la influencia de la inoculación con la promoción del crecimiento vegetal y la producción. Los resultados obtenidos indican que la cepa Rhizobium leguminosarum E11 puede utilizarse como biofertilizante multifuncional con la capacidad de promover el crecimiento vegetal en diversos tipos de hospedadores, además de evidenciar la importancia del nitrógeno en el desarrollo y producción de los cultivos. El mutante de la cepa E11 que sobreexpresa la celulasa CelC2 (E11C2+), tiene incrementada la capacidad de infectar las raíces de arroz y tomate; lo que origina un incremento en la producción de frutos de tomate y semillas de arroz, sin que se vean afectadas sus características nutricionales, lo que la hace un buen candidato como biofertilizante multifuncional.