Regulación de la respuesta a estrés genotóxico en la levadura saccharomyces cerevisiae

Resumen

Con el fin de asegurar la integridad del genoma, las células eucariotas han desarrollado mecanismos de supervivencia, denominados "checkpoints", que coordinan la reparación del daño en el DNA con la progresión por el ciclo celular. En la levadura Saccharomyces cerevisiae la quinasa Rad53 es un regulador central de estos mecanismos. A su vez, es una proteína esencial para el crecimiento normal de las células. Mediante el etiquetado del extremo carboxi-terminal de la proteína Rad53 con el epítopo HA hemos generado una cepa mutante caracterizada por una reducción en los niveles de esta quinasa. Las células de levadura portadoras del alelo rad53HA son aparentemente normales, ya que son viables y no presentan defectos obvios en el crecimiento celular. Sin embargo, cuando se exponen al tratamiento con agentes genotóxicos muestran una sensibilidad desigual respecto al tipo silvestre, lo que indica que son defectivas en la activación de algunos checkpoints. Cuando se expone a estas células al tratamiento con hidroxiurea, una droga que inhibe la síntesis de DNA, pierden viabilidad seguramente debido a un colapso de las horquillas de replicación en progreso, según se observa mediante electroforesis bidimensionales de DNA. En cambio, cuando se exponen a dosis subletales del agente alquilante metil-metano-sulfonato, las células rad53HA son más tolerantes que el tipo silvestre a la droga, presentando un mayor crecimiento en su presencia que podría explicarse por en una desactivación prematura del checkpoint. La proteína de fusión es funcional, como se demuestra en ensayos de autofosforilación in situ. Además, su sobre-expresión revierte las sensibilidades a agentes genotóxicos observadas en la cepa etiquetada, lo que indica que los defectos que presenta se deben a los bajos niveles basales de la quinasa. Este trabajo pone de manifiesto que la modulación de la activación de Rad53 es crítica para un funcionamiento adecuado de los checkpoints.