Clonacion y expresion en escherichia coli de una 1,3-1,4-b-d-glucanasa de bacillus circulans wl-12

Resumen

La especie b. Circulans wl-12 posee capacidad hidrolitica sobre liquenano. La produccion de la actividad 1,3-1,4-b-d-glucanasica detectada es insensible a represion catabolica por glucosa y no responde a induccion por sustrato. La expresion heterologa en e. Coli ha permitido la clonacion molecular de la secuencia que codifica para la actividad 1,3-1,4-b-d-glucanasica en b. Circulans wl-12. Este gen, al que hemos denominado bgc, determina en e. Coli la produccion de una proteina de 40,5 kd, fundamentalmente exocelular, con actividad hidrolitica sobre liquenano. La expresion del gen bgc en e. Coli esta dirigida por su propio promotor, o por secuencias de dna en la region 5, adyacentes a la porcion estructural, reconocidas eficientemente por la rna polimerasa de la bacteria coliforme, puesto que los niveles de proteina sintetizada son independientes de la orientacion del inserto en el vector plasmidico. Por otra parte, el procesamiento del producto del gen bgc en el sistema heterologo es similar al determinado en el sistema de origen, ya que el unico polipeptido con actividad glucanasica detectado en sobrenadantes de e. Coli muestra un perfil electroforetico comparable al observado en sobrenadantes del bacilo grampositivo. La secuenciacion del gen bgc de b. Circulans wl-12 ha permitido concluir que se encuentra incluido en un fragmento hind iii/hind iii de 2,1 kb que presenta una fase de lectura abierta de 1227 nucleotidos con capacidad para codificar una proteina de 409 aminoacidos con un peso molecular de 44.812 dalton. La utilizacion de tripletes en esta region estructural no es aleatoria con una tendencia a codones sinonimos cuya tercera base sea c o g. Esta secuencia nucleotidica no muestra homologia significativa, estimada por hibridacion de acidos nucleicos, con secuencias procedentes de otras especies de bacillus, tanto productoras (b. Polymyxa, b. Amyloliquefaciens, b. Subtilis y b. Coagulans) como no productoras