Estudio de interacciones hospedero-patógeno y proteína-proteína en plasmodium vivaxevaluación de las proteínas del cuello de roptrias -2, -4 y -5 y del antígeno apical de membrana-1

Resumen

La malaria es una de las enfermedades tropicales transmitidas por vectores más importantes a nivel mundial, donde Plasmodium vivax representa una de las especies más ampliamente distribuidas, afectando ~13.8 millones de personas por año. Pese a ello, el progreso aparentemente lento de la infección y los niveles bajos de parasitemia en el humano, comparados a lo reportado en Plasmodium falciparum, han llevado a clasificar a la infección por P. vivax erróneamente como benigna. Esto, sumado a los retos experimentales que trae consigo el cultivo de este parásito, obstaculizan en gran medida el conocimiento a nivel biológico, celular y molecular, necesario para el desarrollo de métodos de control efectivos contra P. vivax. Hoy en día, se conoce que un inadecuado diagnóstico, el mal manejo terapéutico y/o el retraso en el tratamiento, pueden llevar a recaídas y estados de enfermedad grave, similares a los reportados para la malaria producida por P. falciparum, lo que impone retos en la búsqueda de nuevas alternativas específicas contra esta especie. Teniendo en cuenta la necesidad de identificar posibles blancos terapéuticos contra P. vivax, este trabajo se enfocó en estudiar interacciones del tipo receptor-ligando y proteína-proteína de moléculas de P. vivax localizadas en los organelos apicales de esquizontes intraeritrocíticos. Basados en estudios previos en P. falciparum y Toxoplasma gondii, donde se describe la importancia funcional de las proteínas localizadas en el cuello de las roptrias (RONs) -2, -4 y 5 y del antígeno apical de membrana 1 (AMA1), se caracterizó en P. vivax la unión de cada una de estas proteínas con reticulocitos humanos y se evaluó la capacidad de PvRON2 para establecer interacciones con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Para esto, inicialmente se caracterizó mediante herramientas bioinformáticas y experimentales la presencia de los genes pvron4 y pvron5 en el genoma y transcriptoma de esquizontes de la cepa Vivax Colombia Guaviare 1 (VCG-1) de P. vivax. Estos dos genes codifican proteínas de alto peso molecular que se expresan en el polo apical de esquizontes y co-localizan con proteínas presentes en las roptrias. Para evaluar la capacidad de interacción de las proteínas PvRON2, PvRON4, PvRON5 y PvAMA1 con receptores sobre la membrana de reticulocitos humanos, todas ellas fueron producidas de forma recombinante y purificadas mediante cromatografía de afinidad. Se encontró que la proteína recombinante PvRON5 se unió tanto a normocitos como a reticulocitos CD71+, con una marcada preferencia por reticulocitos humanos. Por su parte, las proteínas recombinantes que incluyen los dominios I y II de PvAMA-1 (PvAMA-DI-DII), la región central de la proteína PvRON2 (PvRON2-RI) y la región carboxi-terminal de PvRON4, interactúan específicamente con reticulocitos CD71+CD45-. Los estudios de competencia de unión con péptidos sintéticos que cubren las secuencias de las proteínas recombinantes mostraron que los péptidos 21270 (derivado del DI de PvAMA1), 40305 (de PvRON4) y 40595 (de PvRON2-RI) fueron capaces de inhibir la unión de las proteínas recombinantes a reticulocitos CD71+CD45-, lo que sugiere que estas secuencias peptídicas contienen parte de las propiedades de unión de cada una de las proteínas de las que derivan. Los tres péptidos se unen específicamente y con alta afinidad a eritrocitos con porcentajes de unión mayores al 2% (obtenidas de las curvas de unión específica), permitiendo catalogarlos como péptidos con alta capacidad de unión a eritrocitos (HABPs, del inglés High Activity Binding Peptides). La unión de las proteínas PvAMA1 y PvRON4 a eritrocitos humanos fue sensible al tratamiento de los eritrocitos con diferentes enzimas (tripsina, quimotripsina y/o neuraminidasa), sugiriendo que la naturaleza de los receptores para estas proteínas es de tipo proteico. Estos resultados destacan la función de adhesina de las proteínas evaluadas y revelan las regiones mínimas de interacción con la célula hospedera, que sumado a la expresión de estas proteínas en esquizontes intraeritrocíticos y su localización en organelos apicales, sugieren una fuerte participación de estas moléculas durante el proceso de invasión de los merozoitos de P. vivax a reticulocitos humanos. Finalmente, mediante resonancia de plasmones de superficie, se caracterizaron las interacciones entre la proteína PvRON2 con las proteínas PvRON4, PvRON5 y PvAMA1. Los análisis revelaron que la región carboxi-terminal de la proteína PvRON2 (PvRON2-RII) y PvRON2-RI interactúan específicamente y con alta afinidad con el dominio II y III de PvAMA1 (PvAMA-DII-DIII) y con una menor afinidad con las proteínas PvAMA-DI-DII, PvRON4 y PvRON5. Al modificar algunos residuos de la proteína PvAMA1, reportados en P. falciparum como críticos en la interacción RON2-AMA1, no se encontraron diferencias importantes en los valores de las velocidades de asociación (Kon), disociación (Koff) y en la constante de disociación de la interacción (kD). Esto sugiere que, si bien existen interacciones proteína-proteína (IPP) conservadas entre estos parásitos (Pv-Pf), cada parásito utiliza distintas regiones de las proteínas para interactuar, lo que resalta su capacidad para especializarse o restringirse para invadir un tipo de célula específica y pone de manifiesto aún más la necesidad de diseñar medidas de control específicas contra P. vivax.