PERIANTHIA is a nitric oxide molecular player in Arabidopsis thaliana root stem cell niche

Resumen

La regulación del desarrollo radicular y, por lo tanto, el crecimiento de la planta, está altamente regulada y depende de la coordinación entre los diferentes tipos de células ubicadas en el nicho de células madre (SCN). En ella intervienen una red compleja de multitud de factores que contribuyen en última instancia a su desarrollo. Aunque se conocen los principales mecanismos que intervienen en este evento, es necesario identificar nuevos factores que, de manera adicional o redundante, participan en este proceso. Simultáneamente, el gasotransmisor óxido nítrico (NO) es un regulador importante en múltiples procesos celulares durante la vida de la planta, desde la germinación de semillas hasta la senescencia (Albertos et al., 2015; Sanz et al., 2015). Específicamente, esta molécula tiene una función en la arquitectura de la raíz y su crecimiento, afectando al nivel de organización de su meristemo apical (RAM) (Fernández-Marcos et al., 2011; Sanz et al., 2014). El exceso de NO inhibe drásticamente la longitud de la raíz primaria y altera totalmente el crecimiento de las plántulas, probablemente debido a un estrés nitrosativo causado por un exceso de esta molécula gaseosa. Por otro lado, la transición a la zona de elongación/diferenciación y, por lo tanto, el final del meristemo, se establece en la célula de la fila del córtex cuyo tamaño es el doble que el de la célula anterior. En este sentido, el tratamiento con el donador de NO SNAP o mutantes sobreproductores reducen el tamaño del meristemo y perturban el mantenimiento del centro quiescente (QC), que normalmente es una zona menos activa mitóticamente. Utilizando enfoques genéticos y farmacológicos, a través del uso de mutantes simples y múltiples, líneas transgénicas sobreexpresoras, proteínas recombinantes y compuestos relacionados con NO y ROS, los resultados de esta Tesis, junto con el trabajo publicado en de Luis Balaguer et al. (2017), han demostrado que el factor de transcripción de tipo bZIP PERIANTHIA (PAN) pertenece a la red de reguladores de células madre vegetales, interactuando con diferentes componentes moleculares para modular y regular los procesos de proliferación o diferenciación de las células madre de la raíz. PAN es un factor esencial en la regulación del mantenimiento del RAM, ejerciendo un control sobre las divisiones de las células del QC y la organización de las células madre de la columela (CSC), lo cual está respaldado por varias evidencias. En primer lugar, aunque la expresión de PAN está presente a lo largo de la vida de la planta, se expresa específicamente en el QC a los 5 días post-germinación. Además, el fenotipo obtenido tras el tratamiento con SNAP en plántulas de fondo genético Col-0, con respecto a las células en división del QC y las capas de CSC, se exagera en XVE:PAN, excepto en el tratamiento con el secuestrador de NO cPTIO, por lo que PAN parece estar regulando explícitamente estos procesos a través de un mecanismo dependiente de NO. Asimismo, PAN se une al promotor de WOX5 de una manera dependiente de NO. Varios resultados indican que el NO puede afectar a la expresión de WOX5 a través de la regulación de PAN. Primero, ambos genes parecen estar involucrados en la misma rutagenética (de Luis Balaguer et al., 2017). Segundo, la expresión de WOX5 es totalmente dependiente de PAN. Tercero y más importante, PAN se une al promotor de WOX5 en condiciones reductoras. Además, el tratamiento con GSNO reduce la unión de PAN y esta regulación redox depende de los residuos de cisteína del extremo amino. Al mismo tiempo, la proteína PAN puede experimentar cambios oxidativos que afectan a su patrón de oligomerización, con una participación particular de la cisteína 340. Su mutación imita el estado reducido de la proteína, por lo que cuando el residuo 340 no está presente, PAN no experimenta una oxidación total. Además, 5 de las 6 cisteínas de PAN son S-nitrosiladas in vitro, por lo tanto, este mecanismo se propone como un estado intermedio que protege contra la oxidación completa que evitaría su unión al DNA. Análisis por RNA-seq en la línea transgénica inducible XVE:PAN ha demostrado que la mayoría de los genes diferencialmente expresados en PAN son corregulados en el tratamiento con cPTIO. Este análisis evidencia que PAN regula varias rutas a través de la acción del NO, aunque ambas vías de señalización, PAN y NO, difieren al mismo tiempo en otras dianas génicas. Se podría concluir que PAN necesita un entorno libre de NO para ejercer su función como factor de transcripción, similar al mecanismo que permite la unión al promotor de WOX5. En el tratamiento con cPTIO, la proteína S-nitrosilada a través del NO disminuye, y se propicia un ambiente para la unión de PAN a los promotores relacionados con los procesos de elongación, diferenciación y desarrollo, así como los procesos del metabolismo secundario, funciónes biológicas enriquecidas en los tratamientos con β-estradiol y cPTIO. Por el contrario, el mecanismo de S-nitrosilación se favorece en los tratamientos con el donador SNAP, lo que evita la unión a los promotores de genes diana y provoca la desorganización en el SCN. La ausencia de fenotipos drásticos en el mutante pan durante el desarrollo de la raíz sugiere que PAN puede llevar a cabo sus funciones junto con otras proteínas asociadas. De hecho, se propone como un factor de transcripción capaz de generar heterodímeros (Deppmann et al., 2004). Como resultado del análisis por TAP-tagging, TGA2, TGA3 y TGA5 se asignan como interactores de PAN. Así, la familia de factores de transcripción TGA, identificada tradicionalmente en la respuesta de la planta frente a patógenos, es un componente en el nicho dependiente de NO. A pesar de que no se observan diferencias en los mutantes simples en comparación con las plantas de tipo silvestre, los mutantes múltiples tga2tga5tga6, tga2tga3tga5tga6 y pantga2tga3tga5tga6 muestran una reducción significativa en la longitud de la raíz primaria tanto en condiciones control como en los tratamientos relacionados con NO. De hecho, presentan un meristemo mayor en todas las condiciones observadas, así como desorganización y alta variabilidad en las capas tanto del QC como de la columela. Todos estos resultados indican que esta familia de factores de transcripción es esencial para el mantenimiento del RAM, con una elevada redundancia funcional. Por otra parte, tanto en las células del QC del mutante pan, así como en las puntas de las raíces de XVE:PAN, existen genes diferencialmente expresados que indican que el RAM se desarrollaen un entorno regulado por mecanismos redox. En el conjunto de datos obtenidos tras la inducción de la línea transgénica XVE:PAN, se ha encontrado un mayor número de candidatos relacionados con el redox celular en aquellos tratamientos donde la acción de PAN depende del secuestro de NO por cPTIO. Curiosamente, la glutarredoxina ROXY1 se expresa específicamente en las células del QC. Con respecto al desarrollo de la raíz, la sobreexpresión de ROXY1 disminuye la longitud de la raíz primaria y, en ambos casos, mutante y línea sobreexpresora presentan desorganización en el RAM. Además, parece que la acción de PAN es epistática sobre ROXY1, lo que indica que su función en la raíz es dependiente del redox celular. Se observa que la cisteína 340 de PAN suprime la interacción PAN-ROXY1, probablemente debido a cambios conformacionales en la proteína PAN. Además, en los genes regulados por PAN dependientes de cPTIO se encuentra la categoría funcional relacionada con la homeostasis de los brasinoesteroides (BRs). La proteína BLADE ON PETIOLE (BOP1), conocida también como BRZ-SENSITIVE-SHORT HYPOCOTYL1 (BSS1), es un regulador negativo de la señalización de esta hormona vegetal. Se conoce que BOP1 y su proteína homóloga BOP2 son interactores de PAN en la organización de la arquitectura de las hojas y las flores (Hepworth et al., 2005; Xu et al., 2010). Aquí, también se confirma la interacción entre estas proteínas y, además, que la cisteína 340 de PAN no parece ser esencial en esta interacción. BOP1 parece estar en estado monomérico independientemente del tratamiento redox; por el contrario, BOP2 es susceptible de sufrir cambios conformacionales. Se propone que la S-nitrosilación de BOP1/2 es el mecanismo que, probablemente, module la unión a los factores de transcripción para permitir la expresión de genes específicos. Con respecto a los fenotipos de raíz, parece que la contribución de BOP2 en el desarrollo de la raíz es más significativa que la de BOP1. Así, se plantea que las proteínas de tipo BOP y TGA participen en la misma ruta genética en el desarrollo radicular. El estudio del papel regulador del NO a través de PAN es fundamental para argumentar que el establecimiento y mantenimiento del meristemo de la raíz en las plantas depende, aunque no exclusivamente, de la homeostasis NO. En este sentido, los cambios redox a través de modificaciones post-traduccionales, como la S-nitrosilación y la S-glutationilación de proteínas, son interruptores maestros en estas vías de señalización. Por lo tanto, podría concluirse que existen mecanismos independientes para regular la organización de RAM y que pueden actuar en paralelo, incluso interactuando entre sí.