Mechanisms of auto-regulation and activation of the guanine nucleotide exchange factor c3g

Resumen

C3G es un factor de intercambio de nucleótido de guanina (GEF) de las GTPasas pequeñas celulares Rap1, Rap2, R-Ras, TC21 y TC10 (Gotoh et al. 1995, Gotoh et al. 1997). Estas proteínas promueven el intercambio del nucleótido unido a la GTPasa, facilitando la transición del estado inactivo, unido a GDP, al estado activo, unido a GTP(Cherfils et al. 1999, Vetter et al. 2001). En general, en ausencia de estimulo los GEFs de la familia Ras permanecen en un estado autoinhibido regulado a través de interacciones intramoleculares que envuelven regiones catalíticas y no catalíticas (Pufall et al. 2002). La perdida de estos mecanismos de autorregulación produce una activación espuria de las GTPasas que puede derivar en el desarrollo de enfermedades como Cáncer o enfermedades congénitas (Simanshu et al. 2017). Por ejemplo, la perdida del mecanismo de autoregulación de SOS produce el síndrome de Noonan (Lepri et al. 2011, El Bouchikhi et al. 2016). C3G es una proteína formada por tres regiones estructural y funcionalmente diferentes: (I) la región N-terminal es rica en alfa-hélices, interacciona con E-cadherina, y establece contactos intramoleculares con el dominio REM (Hogan et al. 2004, Gómez-Hernández 2014). Además, el N-terminal de la proteína se une a fosfolípidos, una característica típica de otros GEFs (Gómez-Hernández 2014). (II) la región central, o SH3b, es intrínsecamente desordenada y contiene cuatro motivos ricos en Prolina que median la interacción con proteínas que contienen dominios tipo SH3, como las proteínas Crk (Knudsen et al. 1994, Wu et al. 1995), p130Cas (Kirsch et al. 1998), Grb2 (Tanaka et al. 1994), Hck (Shivakrupa et al. 2003), c-Abl (Radha et al. 2007),y la onco-proteína Bcr-Abl (Gutierrez-Berzal et al. 2006). De todas ellas, las proteínas Crk se unen a C3G con alta afinidad y median la función adaptadora a través del reclutamiento del complejo C3G-CrkL a la membrana, en condiciones de estimulación (Birge et al. 2009, Braiman et al. 2015). C3G contiene en su región central múltiples residuos de Tyrosina, susceptibles de ser fosforilados por las kinasas de las familias Src y Abl. Entre ellos, la fosforilación de la Tyrosina 504 produce la activación de la actividad GEF en células COS1(Ichiba et al. 1999). (III) La región C-terminal, o región catalítica, esta formada por los dominios REM y Cdc25H. El dominio Cdc25H se une directamente a la GTPasa y desestabiliza la interacción del nucleótido unido (Boriack-Sjodin et al. 1998). El dominio REM establece contactos con el dominio Cdc25H que son esenciales para la regulación de su actividad en otros GEFs de la familia (Margarit et al. 2003, Freedman et al. 2006). C3G participa en multitud de funciones en la célula, como el establecimiento de uniones adherentes, la remodelación del citoesqueleto de actina, el desarrollo del sistema nervioso central, la activación de integrinas tras la activación del receptor de células T, y la fisiología plaquetaria entre otros (Nolz et al. 2008, Radha et al. 2011, Gutierrez-Herrero et al. 2012, Martin-Granado et al. 2017, Gutierrez-Herrero 2018). Además ha sido propuesta su participación en enfermedades como la leucemia mieloide crónica (Gutierrez-Berzal et al. 2006), linfomas (Guo et al. 2016), o el carcinoma hepatocelular (Sequera et al. 2018). A pesar de que C3G participa en multitud de funciones en la célula, su estructura tridimensional, así como sus mecanismos de autoinhibición son desconocidos. Además se sabe poco acerca de su proceso de activación a nivel molecular, y en la célula. Existen evidencias que la deleción de la primera mitad de la proteína (residuos 1-579) y la fosforilación de Tyrosinas presentes en la región SH3b produce la activación de C3G (Ichiba et al. 1999). Por otro lado, existen evidencias de que las proteínas Crk son capaces de activar su actividad GEF directamente, de forma independiente al reclutamiento del complejo a la membrana (Popovic 2013) En este trabajo hemos estudiado los mecanismos de autorregulación y activación de C3G. Para ello hemos planteado los siguientes objetivos: (i) La identificación y caracterización de interacciones moleculares que regulan positivamente y negativamente la actividad GEF de C3G. (ii) Entender el efecto de la unión de las proteínas Crk a C3G, y la fosforilación de C3G sobre los mecanismos de autorregulación, y por lo tanto sobre su actividad GEF. (iii) Estudiar las características del complejo C3G-CrkL empleando diversas técnicas biofísicas, mediante una aproximación multi-metodológica. Las conclusiones de este trabajo son: (i) Una interacción entre la región central (SH3b) y la región catalítica de C3G es el principal mecanismo de autoinhibición en C3G. (ii) La región central tiene dos sitios de unión a la región catalítica: Uno de ellos, media la interacción directa entre las dos proteínas, pero no es suficiente para la inhibición. El segundo sitio, establece contactos secundarios con la región catalítica inhibiendo su actividad GEF, siendo estos insuficientes para unirse por si misma. (iii) Se han identificado tres residuos en la región SH3b que son esenciales para la interacción autoinhibitoria. (iv) Se han identificado dos polimorfismos de nucleótido único en pacientes de linfoma no Hodgkin que afectan a residuos esenciales para la interacción. Estos mutantes, al igual que otros no naturales que afectan a estos residuos, producen la activación constitutiva de C3G in vitro y en cultivos celulares. (v) La región N-terminal de C3G interacciona con la región catalítica y modula positivamente la actividad GEF de la proteína. (vi) La unión de CrkL a C3G y la fosforilación de C3G activan la actividad GEF, actuando directamente sobre la interacción autoinhibitoria. (vii) El complejo C3G-CrkL es altamente dinámico. (viii) Las regiones de prolina P1-P4 de C3G no son equivalentes para la unión a CrkL en la proteína completa C3G. (ix) La activación directa de C3G por unión a CrkL es más eficiente que la activación por CrkII.