Genetic and molecular characterization of nitric oxide (no) homeostasis during early plant development in arabidopsis thaliana

Resumen

El desarrollo vegetal se caracteriza por su extrema plasticidad, permitiendo incluso la pérdida de órganos en plantas adultas, ya que su naturaleza autotrófica requiere de grandes superficies que impiden el movimiento. Esta habilidad es posible gracias a la integración de los diversos estímulos ambientales en una compleja red de señalización que converge en la regulación de la división y diferenciación celular. Las estructuras vegetales que gobiernan estos procesos se conocen como meristemos, y contienen células totipotentes que permiten un crecimiento continuo a lo largo de la vida de la planta. Dos meristemos principales dan lugar a todos los órganos vegetales, el meristemo apical del tallo (SAM, por sus siglas en inglés, shoot apical meristem), que produce la parte aérea, y el meristemo apical de la raíz (RAM, root apical meristem), que genera la raíz primaria y controla la arquitectura radicular. Una de las moléculas implicadas en el control del desarrollo vegetal es el óxido nítrico o monóxido de nitrógeno (NO), que fue identificado como un gas de nitrógeno por primera vez en 1789. El reconocimiento de su importancia fisiológica en vegetales no se produjo hasta 1998, cuando diversas publicaciones identificaron a este compuesto como esencial en la respuesta de defensa frente a microorganismos patógenos. El descubrimiento de que las plantas poseen la capacidad de producir NO de forma endógena, y no solo de detoxificar el NO presente en la atmósfera o el suelo, dio lugar a un cambio de paradigma en cuanto a qué moléculas pueden actuar en la transducción de la señal como reguladores del crecimiento y el estrés, lo que permitió identificar otros compuestos reactivos gaseosos de pequeño tamaño que también participan en la regulación de procesos fisiológicos, llamados de forma general gasotransmisores. Los gasotransmisores se caracterizan por ser moléculas gaseosas simples permeables a membranas biológicas, lo que les confiere gran versatilidad. Por otra parte, estas mismas propiedades dificultan el estudio de las condiciones y mecanismos moleculares que gobiernan su homeostasis y señalización. Por este motivo, las rutas de biosíntesis y de señalización del NO no han sido completamente caracterizadas en plantas, aunque ha habido un progreso notable desde que hace veinte años se descubrió que las plantas son capaces de producir NO. Utilizando Arabidopsis thaliana como modelo de estudio y con el objetivo de ampliar nuestro conocimiento sobre estas cuestiones, hemos intentado establecer las condiciones en las que los mutantes sobreproductores de NO nox1/cue1 (NO overproducer 1/chlorophyll a/b binding protein underexpressed) acumulan NO. Además, hemos procurado identificar los fenotipos que se deben inequívocamente a la alteración de la homeostasis del NO para cerrar la brecha existente entre los estudios farmacológicos y genéticos en el campo del NO. Para ello, hemos analizado el fenotipo de cuatro alelos diferentes de cue1 durante la germinación, la elongación de la raíz primaria, y la resistencia a estrés salino, a la vez que cuantificamos el contenido endógeno de NO de cada mutante mediante espectrofluorimetría, para averiguar si existe una correlación entre los fenotipos estudiados y los niveles de NO. Además hemos analizado la producción de NO en diferentes fuentes de carbono para mejorar nuestro conocimiento sobre la interacción entre el metabolismo de carbono y la homeostasis del NO. Nuestros resultados demuestran que los mutantes cue1 son una herramienta muy interesante para el estudio de los efectos fisiológicos del NO durante el crecimiento post-germinativo. La notable variedad funcional del NO proviene de su habilidad para modular las rutas de señalización fitohormonal a múltiples niveles, a través de modificaciones transcripcionales o post-traduccionales de componentes esenciales de su biosíntesis y señalización. Nuestro grupo ha identificado la producción localizada de NO en el nicho de células madres de la raíz, a la vez que ha descubierto que alteraciones en la homeostasis de este compuesto conducen a defectos en la elongación de la raíz primaria y de la proliferación celular en el RAM. Estos procesos están regulados por la fitohormona auxina, por lo que hemos exploramos el papel de la interacción entre ambos reguladores del crecimiento vegetal durante el desarrollo radicular mediante el análisis de la respuesta de los mutantes cue1 a la auxina sintética ácido naftalenacético (NAA) y al inhibidor del transporte polar de auxinas ácido naftil-p-talámico (NPA). También hemos analizado el fenotipo resultante de la introducción de la mutación cue1 en el fondo genético axr1 (auxin resistant 1), que tiene disminuida la respuesta a auxina, durante la elongación de la raíz primaria y la formación de raíces laterales, tratando de explicar efectos aparentemente opuestos del NO en la señalización de auxinas durante el desarrollo radicular. Además, hemos llevado a cabo una caracterización de la distribución polar de los transportadores PIN en mutantes que tienen alterada la homeostasis del NO, tanto en el meristemo apical de la raíz como en el del tallo, y hemos intentado aclarar el papel del NO en este proceso. Nuestros resultados revelan que las alteraciones del crecimiento de la raíz mediadas por NO pueden ser parcialmente explicadas por una reducción del transporte acropétalo de auxinas. El desarrollo de la raíz de A. thaliana es un proceso dinámico que conlleva la integración de diferentes señales para regular complejas redes genéticas. El NO se acumula en las células iniciales del córtex y la endodermis, además de en las células hijas de estas iniciales que dan lugar a los tejidos corticales y endodérmicos, sugiriendo que esta molécula podría tener un papel importante en la regulación de las decisiones de las células madre, como se ha descrito previamente en animales. PROHIBITINA3 (PHB3), una proteína con importantes implicaciones en el desarrollo vegetal, está involucrada en la homeostasis del NO durante el estrés oxidativo y se expresa diferencialmente en el meristemo apical de la raíz. Efectivamente, el análisis del mutante de pérdida de función atphb3 (phb3) nos ha permitido identificar defectos en el desarrollo de la raíz que conllevan la pérdida de identidad celular en los tejidos de la raíz en un mecanismo dependiente del NO, indicando la importancia de este compuesto en el desarrollo vegetal.