Bases moleculares de los fracasos terapéuticos en el tratamiento de la brucelosis con fluoroquinolonas

Resumen

La brucelosis constituye un importante problema de salud pública en diversas áreas geográficas, España entre ellas. Los tratamientos convencionales muestran buenos resultados pero no están exentos de efectos secundarios. Hace años las Fluoroquinolonas (FQ) fueron propuestas como una posible alternativa, pero su elevado porcentaje de recidivas hicieron que este tratamiento fuera inaceptable. Estas recidivas podrían deberse a la perdida de actividad de las FQ en el pH ácido que existe en el interior de los fagolisosomas, pero esta teoría no esta definitivamente demostrada. Sin embargo, no se ha explorado apenas la posibilidad de que este comportamiento se deba a la emergencia de mutantes resistentes. En el presente estudio hemos determinado in vitro y en cultivos celulares de macrófagos, la frecuencia de emergencia de cepas de Brucella con CMIs de fluoroquinolonas elevadas tras su exposición a las mismas, y la presencia en las mismas de mutaciones en los genes gyrA y parC, que codifican las subunidades A de la girasa y la topoisomerasa IV. Método: Infectamos cultivos celulares de macrófagos de perro con una cepa tipo de B. melitensis previamente opsonizada con anticuerpos específicos. Después de una hora de incubación para permitir que las brucelas penetraran en los macrófagos, eliminamos todos los microorganismos extracelulares añadiendo gentamicina al control y gentamicina más una FQ ciprofloxacino (CIP), levofloxacino (LEV) o moxifloxacino (MOX) al resto de los cultivos. Después de horas lisamos los cultivos celulares y se siembra en placas de medio Brucella con CIP, LEV o MOX a una concentración de 4X respecto a la CMI de la cepa tipo. Se determinan las CMIs de CIP, LEV y MOXI de las cepas seleccionadas. En las cepas con un incremento significativo de las CMIs, se secuencian las regiones de los genes gyrA, gyrB y parC similares a la región QRDR de E. coli. Y el gen tolC de la bomba de expulsión. Secuenciamos también una cepa de B. melitensis seleccionada in vitro mediante pases seriados. Resultados: Las CMIs de CIP, LEV y MOX de la cepa silvestre son 0.2, 0.1 y 0.2 ¿g/mL respectivamente. MOX no selecciono ninguna cepa resistente. CIP y LEV seleccionaron cepas resistentes con alta frecuencia, en torno a 1×10-4. Muchas de estas cepas mostraban incrementos en las CMIs de todas las fluoroquinolonas testadas, del orden de 24 ¿g/mL para CIP, 12 ¿g/mL para LEV y 28 ¿g/mL para MOX. La región gyrA muestra una mutación en la cepa seleccionada in vitro Ala51Ser y en las cepas seleccionadas en cultivos celulares de macrófagos Ala67Val. No se encontraron cambios significativos en parC, tolC y gyrB. Conclusiones: El tratamiento con Fluoroquinolonas en cultivos de macrófagos infectados Brucella selecciona cepas resistentes con una alta. La región gyrA muestra una mutación en la cepa seleccionada in vitro Ala51Ser y en las cepas seleccionadas en cultivos celulares de macrófagos Ala67Val. Este hecho puede jugar un importante papel en el tratamiento de la brucelosis FQs.