Caracterización del efecto antiinflamatorio de los bisfosfonatos nitrogenados y su aplicación en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal

Resumen

El carácter antiinflamatorio de las estatinas como inhibidores de la prenilación y los estudios realizados con ellas en modelos preclínicos de EII [1-4] constituyen la base para el planteamiento de esta Tesis Doctoral. En los últimos años se ha demostrado que el carácter antiinflamatorio de las estatinas es mayormente independiente de la reducción en los niveles de colesterol debida a la inhibición de la HMGCoA reductasa. Estos efectos antiinflamatorios han sido relacionados con la inhibición de la prenilación que provocan las estatinas al inhibir la síntesis de restos isoprenoides necesarios para las reacciones de prenilación [5]. La prenilación es un proceso traduccional que supone una modificación de la estructura de las proteínas que consiste en la incorporación de restos lipídicos de tipo isoprenoide a las proteínas sintetizadas, lo que supone una modificación de sus propiedades físicoquímicas y del comportamiento de las mismas. La prenilación es pues un proceso crucial para procesos fundamentales en la célula, como la interacción entre proteínas, el crecimiento de la diferenciación celular, la función del citoesqueleto y el tráfico vesicular. La modificación de la prenilación se plantea como una opción interesante en la investigación farmacológica, ya que la alteración de este proceso puede provocar modificaciones importantes de la biología celular. De hecho, son varios los inhibidores de la prenilación que están actualmente en diferentes fases de investigación preclínica y clínica como anticancerosos [6, 7]. Muchos de los procesos celulares dependientes de la prenilación están relacionados con la respuesta inmune y con la reacción inflamatoria. Además, uno de los principales sustratos para las reacciones de prenilación son las proteínas G de pequeño tamaño molecular o GTP-asas, las cuales están implicadas en la activación de vías de señalización con una gran relevancia a nivel inmunitario. Así, la respuesta inmune podría ser controlada por la modificación de la prenilación y, por tanto, el estudio de la relación entre la prenilación y la inflamación está plenamente justificado. El interés de este planteamiento ha quedado demostrado con los ensayos realizados con estatinas, tanto a nivel cardiovascular como en otros ámbitos. Junto con las estatinas, los bisfosfonatos son fármacos que inhiben el proceso de prenilación y que se emplean actualmente en la práctica clínica, concretamente en el tratamiento de diversas patologías óseas como osteoporosis, osteopenia, enfermedad de Paget, osteogénesis imperfecta o la detección de trastornos óseos de tipo maligno. La inhibición de la prenilación ejercida por los bisfosfonatos nitrogenados consiste en la inhibición de la enzima farnesildifosfato sintasa encargada de la síntesis del farnesildifosfato, uno de los restos isoprenoides que van a ser incorporados a la estructura de las proteínas en el proceso de prenilación. Este fenómeno es el responsable de la capacidad antirresortiva estos compuestos nitrogenados que constituyen la segunda generación dentro del grupo de bisfosfonatos. Según esto, nuestro principal objetivo en esta Tesis Doctoral ha sido la identificación y caracterización del efecto antiinflamatorio de los bisfosfonatos nitrogenados como inhibidores de la prenilación en la EII partiendo de las observaciones realizadas anteriormente con las estatinas. Una vez que se haya demostrado la existencia de un efecto antiinflamatorio por parte de estos fármacos [8], el desarrollo de la tesis se centra en la profundización y caracterización del mecanismo de dicho efecto, así como en las condiciones necesarias para conseguirlo. Por otro lado, un aspecto importante de esta Tesis Doctoral es determinar la relación entre la inhibición de la prenilación y el posible efecto antiinflamatorio de los bisfosfonatos, es decir, establecer si el perfil antiinflamatorio de los bisfosfonatos nitrogenados depende de la inhibición de la prenilación y si se trata de un efecto de clase, común para todos ellos. En una primera aproximación, se han empleado dos modelos preclínicos de EII en rata para determinar si alendronato, ibandronato y/o pamidronato presentan un perfil antiinflamatorio. Dos de los bisfosfonatos empleados, el alendronato y el pamidronato, demostraron un carácter antiinflamatorio en el modelo de colitis por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico. Por el contrario, el ibandronato no ejerce efecto alguno en este modelo experimental, sino que se ha demostrado una reacción sistémica en el tratamiento con este bisfosfonato que se caracteriza por un incremento de la concentración de citoquinas como IL-6 o TNF-¿ en plasma y un empeoramiento del estado general de los animales. El pamidronato ejerce importantes efectos inmunomoduladores también en el modelo de colitis por DSS. En definitiva, podemos señalar que el alendronato y el pamidronato son antiinflamatorios en el modelo de colitis por TNBS; dicho efecto no es dependiente de la inhibición de la prenilación y, por tanto, no se trata de un efecto de clase. Este efecto antiinflamatorio requiere la administración del bisfosfonato por vía oral, ya que la administración por vía intraperitoneal (dosis equivalente según la biodisponibilidad oral de estos fármacos) implica la pérdida del efecto observado en la vía oral. Así, el contacto entre el bisfosfonato y el tejido intestinal es fundamental para el efecto antiinflamatorio. Posteriormente, se seleccionó al pamidronato como molécula de referencia para profundizar en el mecanismo de acción del efecto antiinflamatorio de bisfosfonatos nitrogenados, debido al mejor perfil de éste en el modelo de TNBS y a que el alendronato no es eficaz en el protocolo preventivo que fue el elegido para esta tesis. El análisis del transcriptoma colónico en la colitis por TNBS muestra la capacidad del Pamidronato para normalizar la expresión de un gran número de genes modificados por la inflamación. Pero al establecer una comparación con el efecto observado en el caso de la Sulfasalazina (fármaco antiinflamatorio), podemos concluir que el mecanismo del pamidronato es diferente y puede estar relacionado con la modificación en la expresión de un gran número de genes no relacionados con la inflamación. La administración de pamidronato a ratas sanas también da lugar a efectos inmunomoduladores. La infiltración celular así como el incremento en la producción de citoquinas son característicos, tanto a nivel de ganglios linfáticos mesentéricos como en el bazo. El estudio cinético de este efecto determina que la acción sistémica (en el bazo) es secundaria a las modificaciones observadas a nivel gastrointestinal. En cualquier caso, esta respuesta temprana, 3 días en el caso del mesenterio y 5 días en el bazo se normaliza tras 8 días de tratamiento. Por otro lado, el tratamiento con Pamidronato provoca una inducción en la expresión de Foxp3 en esplenocitos. Todos estos efectos, se acompañan de un incremento de la concentración de IFN-¿ en el plasma. Para la caracterización del mecanismo de acción se ha realizado un amplio espectro de ensayos in vitro en los que el efecto del pamidronato, alendronato e ibandronato ha sido comparado con otras sustancias de interés. Así, han sido incluidos otros dos bisfosfonatos nitrogenados, risedronato y zoledronato, además de un bisfosfonato clásico o no nitrogenado, el etidronato, sin capacidad para inhibir la prenilación. Además, se han empleado tres inhibidores específicos de la vía de prenilación, el FTI-277, inhibidor de la farnesiltransferasa; el GGTI-298, inhibidor de la geranilgeraniltransferasa; y la mevalonina o lovastatina, una estatina que inhibe la síntesis de isoprenoides al bloquear el paso limitante en la ruta del mevalonato. Con este repertorio de sustancias, se ha caracterizado el efecto de los bisfosfonatos y otros inhibidores de la prenilación en diversos modelos celulares, considerando aquellos tipos celulares de especial relevancia en la respuesta inmune y en inflamación intestinal, concretamente enterocitos, linfocitos y macrófagos. Una de las conclusiones principales de estos ensayos in vitro es el diferente comportamiento de los bisfosfonatos nitrogenados y los inhibidores específicos de la prenilación; ya que en la mayoría de los casos el efecto observado es opuesto, y sólo existe un comportamiento similar al de los inhibidores específicos en el caso de los compuestos más potentes como zoledronato o ibandronato. Esto apoya la independencia del efecto antiinflamatorio de alendronato y Pamidronato de la prenilación. Por otro lado, la cinética en la inhibición de la prenilación es importante, de forma que nuestros resultados demuestran que se requiere un período más o menos prolongado (5-7 días) para la inhibición de la prenilación con bisfosfonatos en muchos de los modelos celulares empleados. Tras el tratamiento prolongado, como se ha expuesto anteriormente, una vez que se ha inhibido la prenilación, la acción de los bisfosfonatos más potentes se asemeja al de los inhibidores específicos. En el efecto de los bisfosfonatos sobre enterocitos cabe destacar el perfil del alendronato y del ibandronato sobre las células HT29 y Caco-2 que se pone de manifiesto por el incremento en la producción de IL-8 en el tratamiento prolongado, tanto en condiciones basales, como sobre todo, tras el estímulo de la línea celular. Esto coincide con un incremento dramático en la fosforilación de p38 y ERK. Este fenómeno se relaciona con una cierta toxicidad, especialmente en el caso del alendronato y que puede relacionarse con el fallo de éste en el modelo de TNBS cuando se utiliza un tratamiento preventivo. El ibandronato presenta un claro efecto sobre células mononucleares estimuladas con LPS, así como sobre macrófagos purificados. Dicho efecto consiste en un incremento en la producción de citoquinas, fundamentalmente IL-6 y TNF-¿. Así, el ibandronato podría provocar una estimulación y/o activación de macrófagos, cuyo resultado es la producción de citoquinas en cantidades elevadas. Esta activación puede ser la responsable de la reacción sistémica observada en los experimentos in vivo y del incremento en la concentración de citoquinas en plasma. Por su parte, el pamidronato provoca un incremento en la producción de IFN-¿ en la población de linfocitos T, fenómeno que también se observa en el caso de alendronato, aunque la magnitud del efecto es menor en este último caso. Existen diferentes observaciones en los experimentos en animales que muestran la misma tendencia en el incremento de la producción de IFN-¿: el estudio de expresión génica en el tejido colónico, la producción de citoquinas en esplenocitos estimulados con Con A, en el modelo de TNBS; o el incremento en la concentración plasmática de esta citoquina en ratas sanas tratadas con pamidronato, así como la mayor producción en células mononucleares de ganglios linfáticos mesentéricos o bazo estimulados con Con A de estos animales sanos. Además, el pamidronato incrementa la diferenciación de linfocitos hacia el subtipo Th1, de forma que la producción de IFN-¿ inducida por el tratamiento de los linfocitos con IL-12 se potencia gracias al tratamiento con Pamidronato. Este efecto polarizador no se acompaña de una modificación en la secreción de otras citoquinas características de otros subtipos linfocitarios, aunque sí existe una inhibición en la expresión de IL-23 en linfocitos T estimulados con Con A. Esta capacidad activadora del pamidronato sobre linfocitos T se ve potenciada cuando se establecen cocultivos con enterocitos (sistema TranswellTM), de modo que un contacto prolongado con el bisfosfonato no sólo incrementa la producción la producción de IFN-¿, sino que da lugar a un incremento en la proliferación celular (expresión del antígeno de proliferación celular), una activación de la vía STAT4 y a un incremento en la síntesis de otras citoquinas como IL-6 o IL-10. Todos estos efectos son dependientes del contacto del pamidronato con los linfocitos T dispuestos en el cocultivo, así como de la presencia de la monocapa epitelial en comunicación con éstos.