Caracterización molecular y funcional de las prohibitinas 1 y 2 de trypanosoma cruzi

Resumen

Resumen La Enfermedad de Chagas es la tercera enfermedad parasitaria más común a nivel mundial, estimándose que unos 10 millones de personas se encuentran infectadas, con casi 40.000 nuevos casos y produciendo aproximadamente 8.000 muertes por año. La enfermedad está presente en 21 países de Latinoamérica donde es originalmente endémica. Representando actualmente un problema de salud pública a nivel mundial, debido a las migraciones desde regiones endémicas de Latinoamérica a países no endémicos de Norteamérica (norte de Estados Unidos y Canadá), sudeste asiático (Japón y Australia) y Europa (España, Portugal, Francia o Suecia entre otros) generado la diseminación del parásito Trypanosoma cruzi por vías no vectoriales. El ciclo completo de T. cruzi es digenético debido a su desarrollo en mamíferos y en insectos triatominos que actúan como hospedadores intermediarios. T. cruzi presenta tres fases biológicas y fisiológicamente diferentes, las cuales se identifican morfológicamente por la posición relativa del kinetoplasto en relación al núcleo y el flagelo, siendo las mismas: epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes (metacíclicos o sanguíneos), de las cuales los epimastigotas son la forma replicativa en el insecto vector y los amastigotas en el hospedador mamífero. La enfermedad de Chagas puede resultar en diferentes formas clínicas, que dependen de factores ambientales y genéticos tanto del hospedador como del parásito. Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad se pueden dividir en fase aguda o crónica, siendo la fase aguda de duración corta (20 a 30 días) y alta parasitemia en sangre, en la cual se presenta signos clínicos poco definidos, como fiebre, astenia, cefalea, entre otros. Alcanzando posteriormente la fase crónica, las cuales se las puede dividir en asintomática y sintomática. En la primera, el sistema inmunitario del hospedador limita la proliferación inicial pero el parásito ejerce una inmunomodulación que permite la persistencia y una baja parasitemia, permaneciendo durante años sin presentar signos clínicos de enfermedad. La segunda se caracteriza por la aparición de manifestaciones clínicas donde los individuos infectados, según el tropismo de la cepa que poseen, desarrollarán lesiones irreversibles del sistema nervioso autónomo, en el corazón, esófago, colon y sistema nervioso periférico, los cuales pueden llegar a ser letales. Hasta hoy en día no se cuenta con una vacuna contra la enfermedad de Chagas, teniendo disponible sólo dos fármacos para el tratamiento, el Benznidazol y el Nifurtimox, los cuales pueden curar al menos el 50% de las infecciones que se encuentran en la fase aguda. Sin embargo, una vez que alcanzan la fase crónica, los medicamentos sólo ayudan a controlar la infección. El inconveniente de dichos fármacos es la necesidad de un período de tratamiento extenso y la variedad de efectos colaterales, pudiendo afectar incluso al sistema nervioso. Por todo ello, es de suma importancia buscar nuevas dianas terapéuticas o de diagnóstico para el control de la enfermedad, para lo cual es imprescindible entender la complejidad de su biología y de los diferentes estadios dentro de su ciclo de vida, así como los mecanismos que lo ayudan a sobrevivir. Las Prohibitinas 1 (PHB1) y 2 (PHB2) son dos proteínas homólogas, las cuales pertenecen a la super familia SPFH (Stomatin, Prohibitin, Flotillin and HflC). En T. cruzi presentan un 41% de identidad entre sus secuencias aminoacídicas y ambas contienen el motivo PHB, también conocido como SPFH o Band-7, que se encuentra próximo al segmento transmembrana en el extremo N-terminal de las proteínas. La función exacta de dicho motivo es aún desconocida, aunque se encuentra conservado a lo largo de la escala evolutiva, desde procariotas a eucariotas, incluyendo al hombre; sugiriendo así una importante función celular. Se han descrito miembros de la familia de las PHBs con distintas localizaciones, encontrándose principalmente en la membrana interna de la mitocondria, el núcleo y la membrana plasmática, las cuales han sido relacionadas con funciones como la proliferación celular, envejecimiento, apoptosis, estabilización del ADN mitocondrial, mantenimiento de la integridad mitocondrial, entre otros. El principal propósito de esta Tesis Doctoral es la caracterización molecular y el estudio de la funcionalidad de las proteínas PHB1 y PHB2 de T. cruzi. Para ello, se ha realizado la clonación y expresión de las PHBs de T. cruzi en E. coli, a fin de obtener anticuerpos a partir de las proteínas recombinantes. Dichos anticuerpos se han utilizado para la determinación de la localización subcelular de las PHBs en diferentes estadios del parásito a través de microscopia de fluorescencia y electrónica, observándose una localización diferencial entre las distintas formas. Asimismo se ha analizado la expresión de las proteínas de interés en diferentes formas de T. cruzi, observándose una mayor expresión en el estadio de epimastigotes. También se ha determinado que al igual que las PHBs de L. major, las de T. cruzi poseen la capacidad de unión al Fe3+ y en ensayos in vitro, pueden proteger al ADN de la acción del H2O2 inhibiendo la reacción de Fenton, en la cual se forman especies reactivas de oxígeno (ROS). Para determinar el papel de las PHBs en la biología del parásito se han sobreexpresado las PHBs de T. cruzi de forma exitosa y mediante el sistema CRISPR/Cas9 se ha intentado realizar líneas knockout para los genes phb1 y phb2, de las cuales se ha conseguido una línea disminuida para la PHB1 y otra línea knockout para la PHB2, demostrando que la falta del gen phb2 es letal para el parásito. Asimismo, con las líneas que sobreexpresaron a las PHBs se ha determinado el posible papel de dichas proteínas en los diferentes estadios de T. cruzi, observándose que en el estadio de epimastigotes la sobreexpresión de las PHBs no afectó al crecimiento del protozoo. Además se determinó que tanto la PHB1 como la PHB2 están implicadas en la protección al parásito frente a condiciones de estrés oxidativo. En este estudio también se ha determinado que las PHBs no favorecen la infección, pero una vez los tripomastigotes penetraron en las células, si se observó que la sobreexpresión de las PHBs en el estadio de amastigotes favoreció la capacidad de multiplicación intracelular del parásito. Finalmente, la antigenicidad de la PHB2 ha quedado demostrada dado que la proteína recombinante PHB2 es reconocida antigénicamente por los sueros de pacientes chagásicos. Summary Chagas disease is the third most common parasitic disease worldwide. Approximately 10 million people are infected, with almost 40,000 new cases and 8,000 deaths per year. This disease is present in 21 countries in Latin America where it is originally endemic. Due to migrations from endemic regions of Latin America to non-endemic countries of North America (northern of the United States and Canada), Southeast Asia (Japan and Australia) and Europe (Spain, Portugal, France, Sweden, etc.) this disease represents a worldwide public health problem, spreading the parasite Trypanosoma cruzi without the participation of the vector. T. cruzi has a digenetic life cycle that includes developmental stages in mammals and in triatomine insects, which acts as intermediate hosts. This parasite has three different biological and physiological phases, which can be differentiated by the position of the kinetoplast in relation to the flagella and the nucleus, among others characteristics. These phases are epimastigotes, amastigotes and trypomastigotes (metacyclic or bloodstream), being the epimastigote stage the replicative form inside the insect vector and the amastigote stage inside the mammalian host. Chagas disease can result in different clinical forms, which depend on environmental and genetic factors of the host and the parasite. The clinical manifestations of this disease can be divided into acute and chronic phases. The acute phase is characterized for having short duration (20 to 30 days) and for the presence of high parasitemia in blood, with inespecific clinical signs such as fever, asthenia, and headache, among others. Later, the chronic phase develops and can be divided into asymptomatic and symptomatic. In the first, the host immune system limits the initial proliferation, but the parasite exerts immunomodulation that allows persistence and a low parasitemia, remaining for years without presenting clinical signs. The second is characterized by the appearance of clinical manifestations, where the infected individuals depending, on the tropism of the infecting parasite’s strain, could develop irreversible lesions of the autonomic nervous system, the heart, esophagus, colon and peripheral nervous system. At the moment, there is no vaccine against Chagas disease and only two drugs are available for the treatment: Benznidazole and Nifurtimox. These drugs can cure at least 50% of the infections while in the acute phase. However, once they reach the chronic phase, medication can only help to control the infection. The drawback of these drugs are the need of a long treatment period and a wide range of side effects, including the nervous system. Therefore, to improve the control of Chagas disease it is important to search for new diagnostic or therapeutic targets, and in this quest, it is essential to understand the complexity of the biology and the different stages of the parasite within its life cycle, as well as their survival mechanisms. Prohibitins 1 (PHB1) and 2 (PHB2) are two homologous proteins, that belong to the superfamily SPFH (Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflC). In T. cruzi, they have 41% of identity in their amino acid sequences and both contain the PHB motif, also known as SPFH or Band-7, which is located close to the transmembrane segment at the N-terminal of these proteins. The exact function of this motif is still unknown, but it is conserved along the evolutionary scale, from prokaryotes to eukaryotes, including man, thus suggesting an important cellular function. Members of the PHBs family have been described at different cell locations, mainly found in the inner mitochondrial membrane, the nucleus and the plasma membrane. These proteins have been associated with many functions such as cell proliferation, ageing, apoptosis, the stabilization of mitochondrial DNA, and maintenance of mitochondrial integrity, among others. The main purpose of this Doctoral Thesis is the molecular characterization and the functional study of the PHB1 and PHB2 proteins of T. cruzi. First, in order to obtain antibodies, cloning and expression of the PHBs from T. cruzi in E. coli have been carried out. These antibodies have been employed to determine the subcellular localization of the PHBs through fluorescence and electronic microscopy, observing a differential localization among the different forms of the parasite. Likewise, it has been compared the expression of these proteins in the different forms of T. cruzi, observing a major expression in the epimastigote stage. It has also been determined in vitro that PHBs from T. cruzi, as well as L. major, possess the ability to bind Fe3+ and protect the DNA from the action of H2O2, inhibiting the Fenton reaction, which reactive oxygen species (ROS) are generated. To determine the role of PHBs in the parasite's biology, these proteins have been successfully overexpressed and attempted to make knockout lines for the phb1 and phb2 genes. For the first line, a decrease in the expression of the PHB1 has been observed and for the second one, a knockout line, the lack of phb2 was demonstrated to be lethal to the parasite. In the stage of epimastigotes, the lines overexpressing the PHBs did not affect the parasite’s growth, but these lines were more capable to resist oxidative stress. In this study, it was also determined that the PHBs do not favor the infection, but once the trypomastigotes penetrated the host cells, those cells overexpressing PHBs favored the intracellular multiplication of the amastigotes forms. Finally, antigenicity of PHB2 has been demonstrated since the recombinant PHB2 protein is recognized by the sera of chagasic patients.