Regulación redox de procesos de señalización en el cloroplasto. La función de NTRC

  1. GUINEA DIAZ, MANUEL
Supervised by:
  1. Francisco Javier Cejudo Fernández Director

Defence university: Universidad de Sevilla

Fecha de defensa: 11 April 2012

Committee:
  1. María Dolores Rodríguez Martín Chair
  2. Antonio José Márquez Cabeza Secretary
  3. Luisa María Sandalio González Committee member
  4. Agustín González Committee member
  5. Mariam Sahrawy Barragán Committee member

Type: Thesis

Teseo: 332213 DIALNET

Abstract

REGULACIÓN EDOX DE PROCESOS DE SEÑALIZACIÓN EN EL CLOROPLASTO. LA FUNCIÓN DE NTRC. La fotosíntesis es la principal fuente de biomasa y oxígeno de la biosfera. A pesar de su importancia para el mantenimiento de la vida en el planeta, es también un proceso en el que se produce transporte de electrones en presencia de oxígeno, por lo que constituye una fuente importante de ROS (Reactive Oxygen Species) potencialmente dañinos para estos organismos. Además, el estrés oxidativo generado por el incremento de la producción de ROS se agudiza en condiciones ambientales adversas, como sequía, salinidad, frío y alta intensidad lumínica, que son muy comunes en agricultura. En los últimos años, se ha observado que las ROS desempeñan una importante función señalizadora, actuando directamente como señales indicadoras de las condiciones ambientales o bien como segundos mensajeros implicados en diversos procesos de desarrollo y diferenciación (Mittler et al, 2011). Debido a esta dulidad de función de ROS en la célula vegetal, las plantas han debido desarrollar, a lo largo de su evolución, una serie de mecanismos que les permitan regular eficientemente los niveles de estas especies. Entre los sistemas de regulación de los niveles de ROS se encuentran las 2-Cys Peroxirredoxinas (2-Cys Prxs). Estas son peroxidasas con estructura homodimérica, que participan en la regulación de los niveles de H2O2 en la célula. El mecanismo catalítico de estas peroxirredoxinas ha sido ampliamente estudiado: la cisteína catalítica, peroxidática, de estas 2-Cys Prxs ataca al peróxido generándose un intermediario sulfénico, que reacciona entonces con el grupo tiólico de la Cys resolutora de la otra subunidad, con la consiguiente producción de una molécula de agua y la formación de un enlace disulfuro intersubunidad (Chae et al, 1994; Chae et al, 1999). Cuando termina un ciclo catalítico, la 2-Cys Prx se encuentra por tanto con ambas Cys, peroxidática y resolutora, formando un puente disulfuro que ha de ser reducido para que se produzca un nuevo ciclo catalítico. La reducción de estos puentes disulfuro está catalizada por un sistema formado por Tiorredoxina (Trx) y Tiorredoxina Reductasa (TR), que, actuando de forma conjunta, son capaces de transferir poder reductor a las 2-Cys Prxs. Este poder reductor puede proceder de NADPH o de Ferredoxina (Fd) reducida, según el tipo de TR que participe en la reacción. En Arabidopsis thaliana existen dos isoformas de 2-Cys Prx, llamadas 2-Cys Prx A y 2-Cys Prx B, con localización cloroplastídica (Dietz et al, 2002). La reducción de estas 2-Cys Prx puede ser llevada a cabo por un sistema Trx/FTR (que utiliza poder reductor procedente de Fd reducida), o bien por NTRC, un tipo particular de NTR caracterizado por presentar un dominio Trx en su extremo C-Terminal, capaz de trasferir poder reductor prodecente de NADPH (Serrato et al, 2004). Esta proteína ha mostrado ser un reductor de 2-Cys Prx mucho más eficiente que otras Trxs cloroplastídicas como Trx x o CDSP32, que eran consideradas hasta entonces como los reductores fisiológicos de estas peroxirredoxinas (Alkhalfioui et al, 2007; Moon et al 2006; Pérez-Ruiz et al, 2006). Un mutante KO para NTRC en Arabidopsis muestra alteraciones en el estado redox de 2-Cys Prx, presentando una menor proporción de 2-Cys Prx reducida y un menor grado de sobreoxidación de esta proteína (Kirchsteiger et al, 2009). El proceso de sobreoxidación de 2-Cys Prx se asocia con la función señalizadora llevada a cabo por esta enzima (Wood et al, 2003) por lo que la carencia de NTRC podría afectar a procesos de señalización mediados por 2-Cys Prx. Otros fenotipos observados en este mutante, como por ejemplo la acumulación de intermediarios de la síntesis de clorofila y un incorrecto funcionamiento de la maquinaria biosintética de porfirinas, pueden afectar a procesos de señalización retrógrada entre el cloroplasto y el núcleo, encargados de coordinar el metabolismo cloroplastídico con el resto de la célula (Nott et al, 2006; Rodermel, 2001). La señalización por ácido abscísico (ABA) también podría verse afectada en este mutante, como sugiere la mayor sensibilidad a estrés y el retraso de crecimiento observados en el mutante (Perez-Ruiz et al, 2006). Sorprendentemente, las alteraciones fenotípicas observadas en este mutante son mayores que las presentadas por un mutante con niveles reducidos de 2-Cys Prx (Pulido et al, 2010). Este hecho sugiere que deben existir otras importantes dianas de NTRC en Arabidopsis. El objetivo de este trabajo es determinar qué otras funciones desempeña NTRC en Arabidopsis thaliana y la importancia de esta proteína en la regulación redox del cloroplasto. Para llevar a cabo este estudio se han planteado los siguientes objetivos: - Función de NTRC en el control del estado redox de 2-Cys Prx. - Función de NTRC en procesos de señalización : o Señalización retrógradada entre el cloroplasto y el núcleo o Señalización por ABA Los resultados obtenidos sobre el estudio del estado redox de 2-Cys Prx en Arabidopsis sugieren que este depende de NTRC y Srx. La comparación del nivel de sobreoxidación de 2-Cys Prx en los mutantes ntrc y srx mostró que la carencia de alguna de estas enzimas afecta al nivel de sobreoxidación de 2-Cys Prx, si bien NTRC es esencial para que se pueda producir el proceso de sobreoxidación. En organismos procarióticos se observa una diferente sensibilidad a sobreoxidación de 2-Cys Prx. En el caso de Synechocystis, que carece de NTRC, la sensibilidad a sobreoxidación es muy reducida. Esta insensibilidad a sobreoxidación se debe a que la enzima se mantiene más oxidada en esta cianobacteria, lo cual dificulta el proceso de sobreoxidación. Si se imposibilita la formación del puente disulfuro entre las cisteínas peroxidática y resolutora, la 2-Cys Prx muestra una sensibilidad a sobreoxidación similar a la observada en Anabaena y Arabidopsis, lo que indica que la formación de este puente disulfuro protege frente a sobreoxidación. La Srx de Arabidopsis thaliana muestó actividad de reversión de sobreoxidación de 2-Cys Prx de estos organismos procarióticos. El mutante ntrc no mostró alteraciones en la señalización retrógrada pero si presentó insensibilidad a ABA. La Mg-quelatasa ha sido descrita como un receptor cloroplastídico de ABA (Shen et al, 2006). En los experimentos realizados se pudo observar interacción entre NTRC y la subunidad I de la Mg-quelatasa in vivo. Esta interacción determina el estado redox de esta subunidad y, por tanto, su actividad ATPasa. La insensibilidad a ABA observada en el mutante ntrc es comparable a la observada en líneas con niveles reducidos de CHLI en Arabidopsis thaliana, y se debe probablemente a su interacción con CHLI. BIBLIOGRAFÍA Alkhalfioui F, Renard M y Montrichard F (2007). Unique properties of NADP-thioredoxin reductase C in legumes. J Exp Bot, 58, 969¿978. Chae HZ, Kim HJ, Kang SW y Rhee SG (1999). Characterization of three isoforms of mammalian peroxiredoxin that reduce peroxides in the presence of thioredoxin. Diabetes Res Clin Pract, 45, 101-112. Chae HZ, Uhm TB y Rhee SG (1994). Dimerization of thiol-specific antioxidant and the essential role of cysteine 47. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 7022-7026. Dietz K-J, Horling F, Konig J y Baier M (2002). The function of the choloplast 2-cysteine peroxiredoxin in peroxide detoxification and its regulation. J Exp Bot, 53, 1321-1329. Kirchsteiger K, Pulido P, González M y Cejudo FJ (2009). NADPH Thioredoxin reductase C controls the redox status of chloroplast 2-Cys peroxiredoxins in Arabidopsis thaliana. Mol Plant, 2, 298-307. Mittler R, Vanderauwera S, Suzuki N, Miller G, Tognetti VB, Vandepoele K, Gollery M, Shulaev V y Van Breusegem F (2011). ROS signaling: the new wave? Trends Plant Sci, 16, 300-309. Moon JC, Jang HH, Chae HB, Lee JR, Lee SY, Jung YJ, Shin MR, Lim HS, Chung WS, Yun D, Lee KO y Lee S (2006). The C-type Arabidopsis thioredoxin reductase ANTR-C acts as an electrondonor to 2-Cys peroxiredoxins in chloroplasts. Biochem Biophys Res Commun, 348, 478¿484. Nott A, Jung HS, Koussevitzky S y Chory J (2006). Plastid to-nucleus retrograde signaling. Annu Rev Plant Biol, 57, 739¿759. Pérez-Ruiz JM, Spínola MC, Kirchsteiger K, Moreno J, Sahrawy M y Cejudo FJ (2006). Rice NTRC is a high-efficiency redox system for chloroplast protection against oxidative damage. Plant Cell. 18, 2356¿2368. Pulido P, Spínola MC, Kirchsteiger K, Guinea M, Pascual MB, Sahrawy M, Sandalio LM, Dietz KJ, González M y Cejudo FJ. (2010) Functional analysis of the pathways for 2-Cys peroxiredoxin reduction in Arabidopsis thaliana chloroplasts. J Exp Bot, 61, 4043¿4054. Rodermel S (2001). Pathways of plastid-to-nucleus signalling. Trends Plant Sci, 10, 471¿478. Serrato AJ, Pérez-Ruiz JM, Spínola MC y Cejudo FJ (2004) A novel NADPH thioredoxin reductase, localized in the chloroplast, which deficiency causes hypersensitivity to abiotic stress in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem, 279, 43821¿43827. Shen YY, Wang XF,Wu FQ, Du SY, Cao Z, Shang Y,Wang XL, Peng CC, Yu XC, Zhu SY, Fan RC, Xu YH y Zhang DP (2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature, 443, 823¿826. Wood ZA, Schröder E, Harris JR y Poole LB (2003). Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem Sci, 28, 32¿40.