Diversidad, dinámica poblacional y ecología de hongos entomopatógenos de suelo y filoplano de sistemas agroforestales mediterráneos y efecto de la radiación uv-b sobre su virulencia

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis. El control biológico por medio de hongos entomopatógenos emerge en la actualidad como la gran alternativa a los insecticidas químicos y ha despertado el interés de todos los agentes implicados en la protección de cultivos (Foley et al., 2011; Popp et al., 2013). Sin embargo, su éxito comercial e implantación progresiva se enfrentan con demasiada frecuencia a una barrera limitante, la falta de eficacia en campo, debido en gran parte a la poca competencia ambiental de las cepas seleccionadas, cuya actividad queda neutralizada por distintos factores bióticos y abióticos, donde destaca, dentro del espectro solar, la radiación UV-B (Meyling y Eilemberg, 2007; Vega et, al., 2009; Lacey, 2017, Quesada-Moraga et al., 2013). Esta Tesis ha pretendido dilucidar el efecto real de dicha radiación sobre la virulencia de los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos (AMEs), así como la presencia natural de estos hongos en el filoplano, donde las condiciones ambientales operantes no parecen favorables para su presencia, y su relación con la respuesta a las condiciones de temperatura, humedad y radiación UV-B. 2. Contenido de la investigación. A lo largo de los distintos capítulos de la presente Tesis Doctoral, se ha constatado la presencia, diversidad y dinámica poblacional de los AMEs en el suelo y filoplano de plantas herbáceas y leñosas en cinco ecosistemas mediterráneos con diferentes grados de manejo (olivar ecológico, olivar tradicional, reforestación de encina, dehesa y plantación de girasol), durante las cuatro estaciones de un año completo. Además, se ha evaluado la respuesta diferencial de aislados pertenecientes a varias especies de AMEs (procedentes de suelo y filoplano), a distintos factores abióticos de estrés (temperatura, humedad y radiación UV-B), determinantes de su presencia, persistencia y virulencia, con el fin de obtener herramientas útiles para la selección de cepas con competencia ambiental. En el capítulo II, se evaluó la presencia, diversidad y dinámica poblacional de los AMEs presentes en el suelo y filoplano de plantas leñosas y herbáceas procedentes de cinco ecosistemas mediterráneos con diferentes grados de manejo durante un año completo. En total se aislaron 697 aislados de AMEs que se identificaron mediante su caracterización morfológica y la secuenciación del factor de elongación 1α (EF-1α), lo que los incluyó en las especies: Beauveria amorpha, B. bassiana, B. pseudobassiana, B. varroae, Metarhizium brunneum, M. guizhouense, M. robertsii, Paecilomyces marquandii y Purpureocillium lilacinum. La riqueza de especies, la diversidad y la uniformidad se calcularon, mediante el uso de distintos índices, para cada ecosistema y hábitat, obteniéndose la siguiente clasificación que correlacionó la diversidad de los ecosistemas con la intensidad de manejo de los mismos: repoblación de encina > olivar ecológico > olivar tradicional > dehesa > plantación de girasol. Por otro lado, el análisis ISSR reveló una alta diversidad genotípica entre los aislados de B. bassiana, que no mostró una relación directa entre dicha característica genética y el hábitat de aislamiento de los AMEs (suelo o filoplano). Estos resultados sugieren que los aislados del filoplano tienen su origen en el suelo, su principal reservorio, los cuales son dispersados por agentes como el viento, la lluvia o la actividad de los insectos. No obstante, se detectó un grupo genético con aislados sólo procedentes del filoplano de encinas, que podría identificar a estos microorganismos como verdaderos epifitos. En el capítulo III se evaluó la influencia del genotipo de los AMEs, el hábitat de aislamiento (suelo o filoplano) o la región geográfica de los mismos sobre su respuesta a los principales factores ambientales, temperatura, humedad y la radiación UV-B, condiciones que pueden afectar a su uso en el control microbiano, sobre todo en aplicaciones aéreas. Para ello, se seleccionaron 20 aislados de B. bassiana obtenidos del suelo y filoplano de encina, de dos de los cinco ecosistemas estudiados anteriormente (repoblación de encina y dehesa). Para ver la distribución poblacional de estos aislados y evaluar sus requerimientos térmicos, de humedad y UV-B, se caracterizaron mediante EF-1α, la región nuclear intergénica Bloc y 15 marcadores microsatélites (SSR). Al igual que en los resultados obtenidos en el capítulo anterior, se obtuvieron grupos genéticos que tenían aislados tanto de suelo como de filoplano en el mismo clado o genotipo, pero de nuevo apareció un grupo con solo aislados de filoplano, que podrían ser verdaderos epífitos. Para investigar la hipótesis de si los aislados de filoplano presentan una mayor respuesta a las condiciones de estrés ambiental en relación a los de suelo, se analizó el efecto de la temperatura (germinación y crecimiento de colonias evaluadas entre 15-35° C), la actividad de agua o aw (germinación de conidios evaluada frente a valores de aw entre 1 y 0.862) y la exposición a la radiación UV-B (920 o 1200 mW m-2 durante 2, 4 ó 6 h). Como resultado no se encontraron asociaciones entre el genotipo, el hábitat (suelo o filoplano) y el ecosistema de aislamiento, peso sí se encontraron aislados con un carácter excepcional frente al estrés ambiental típico de la zona mediterránea. Estos resultados no apoyan la hipótesis de partida de que los aislados de AMEs presentes en el filoplano de las plantas pudieran mostrar mayor tolerancia al estrés ambiental que los del suelo, si bien, indican que existen aislados con gran tolerancia a la ausencia de humedad (aw), altas temperaturas y condiciones extremas de radiación UV-B, que son especialmente interesantes para su uso en el control integrado de plagas en zonas semiáridas. Dado que la radiación UV-B parece ser el factor más limitante al que los AMEs están expuestos en el medio ambiente y principalmente en las zonas epigeas, en el capítulo IV se estudió si la respuesta a dicho estrés es la misma para todas las especies de AMEs y si ésta radiación afecta a la virulencia y viabilidad de los aislados en cuestión. Para ello se seleccionaron 18 cepas de 3 especies de Metarhizium sp.: M. guizhouense, M. robertsii y M. brunneum. En general, todas las cepas mostraron una disminución significativa en la germinación de los conidios que en ningún caso superó el 30%, así como una baja capacidad de recuperación de los mismos, siempre asociada con el tiempo de exposición. Sin embargo, y como ocurrió en el caso de B. bassiana, no se encontró relación entre las especies de Metarhizum o el hábitat de procedencia de la cepa (suelo o filoplano) y el efecto de la radiación UV-B. Finalmente, para determinar el efecto de la radiación UV-B sobre la virulencia de los AMEs tanto in vitro como in vivo, se seleccionó la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum que fue la que presentó una mayor resistencia a la radiación UV-B de todos los aislados con potencial para ser desarrollados como micoinsecticidas. En una primera serie de bioensayos, los conidios puros de la cepa en cuestión se irradiaron con 1200 mW m-2 durante 6 horas antes o después de inocular adultos de C. capitata con la misma, que dio lugar a una disminución significativa de mortalidad. Curiosamente, ésta pérdida de virulencia no se observó cuando lo insectos fueron tratados con el hongo y luego irradiados sobre el exoesqueleto del mismo. No obstante, en ambos casos se observó una importante pérdida de viabilidad de los conidios, que alcanzó un 70%. Para determinar si la dosis del hongo aplicada puede explicar este fenómeno de pérdida de viabilidad y no de virulencia, se realizó una segunda serie de experimentos donde las moscas adultas de C. capitata se inocularon con cinco dosis de una suspensión a base se conidios puros de la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum (1.0x104 a 1.0x108 conidios ml-1) y luego se irradiaron a 1200 mW m-2 durante 6 horas. Como resultado se obtuvieron valores similares de CL50 que fueron de 3.8×107 y 4.3×107 conidios ml-1, para los insectos inoculados con el hongo e irradiados con radiación UV-B y los que no fueron irradiados, respectivamente. Dado que la dosis del hongo aplicado seguía sin explicar el fenómeno antes mencionado, se trataron moscas adultas con una suspensión de 1.0×108 conidios ml-1 y luego expuestos a 1200 mW m-2 durante 0, 6, 12, 24, 36 y 48 horas. De acuerdo con el modelo logístico de 3 parámetros y el modelo exponencial, el tiempo de exposición a la radiación UV-B (1200 mW m-2) necesario para reducir la mortalidad de los adultos de C. capitata fue de 47.2 horas, mientras que para reducir la viabilidad un 50% de los conidios sobre las moscas en las mismas condiciones fue de 5.6 horas. Estos resultados revelan la falta de correspondencia entre la pérdida de viabilidad de los conidios, aproximadamente el 85% independientemente de si el hongo es irradiado antes o después de tratar a los insectos, y la virulencia, pues la disminución de la primera por efecto de la radiación UV-B no es suficiente para evitar que un número viable de conidios restantes supere el umbral para comenzar el proceso patogénico. Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral aportan herramientas que facilitan la búsqueda y selección de cepas AMEs mejor adaptadas a las condiciones ambientales mediterráneas y con mayor competencia ambiental a las zonas donde se van a utilizar, para superar, con ayuda de la formulación y el método de aplicación, la principal limitación para su eficaz desarrollo y empleo en campo en programas de control integrado de plagas. 3. Conclusiones. 1.- El análisis combinado de los marcadores EF-1α e ISSR proporciona una alta sensibilidad para la detección y estudio de la presencia, diversidad y distribución poblacional de AMEs en el medio natural. 2.- Existe una importante presencia de AMEs en el filoplano de plantas leñosas y herbáceas en diferentes ecosistemas mediterráneos, aparentemente procedentes del suelo, considerado su principal reservorio. No obstante, existe un grupo genético con aislados sólo procedentes del filoplano de encina, lo que nos lleva a pensar que podría tratarse de un nuevo carácter de los AMEs, como epífitos, no descrito hasta la fecha. 3.- La diversidad y dinámica poblacional de AMEs depende en gran medida del grado de manejo de los ecosistemas en los que se encuentran, es decir, existe una mayor diversidad de AMEs cuanto menos modificado está el medio, así como de la estación del año, con mayor presencia en primavera, sin embargo, dicha diversidad y dinámica poblacional no guardan relación directa con la presencia de AMEs en el suelo y el filoplano de plantas leñosas o herbáceas. 4.- No se encuentra relación entre el tipo de secuencia (EF-1α y Bloc), el genotipo, el hábitat de aislamiento (suelo o filoplano) o el ecosistema (dehesa o repoblación de encina) de los 20 aislados de B. bassiana seleccionados y su respuesta a la temperatura, la actividad del agua o la radiación UV-B, lo que cuestiona la hipótesis de que las cepas del filoplano hayan podido evolucionar para resistir condiciones ambientales desfavorables. 5.- Existen aislados de B. bassiana con una respuesta excepcional frente a factores abióticos típicos de ambientes áridos, que no guarda relación con su genotipo, hábitat o ecosistema de aislamiento. 6.- Tampoco se observa una relación entre el hábitat de aislamiento o el ecosistema de los aislados de Metarhizium brunneum, M. guizhouense y M. robertsii y su respuesta a la radiación UV-B. 7.- Existe un efecto significativo de la radiación UV-B sobre la virulencia de la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum frente a adultos de C. capitata, que sólo depende del tiempo de exposición de sus conidios a dicha radiación y no de la dosis del hongo suministrada a los insectos, a pesar de existir una importante reducción en la viabilidad de los conidios irradiados. Este efecto es mayor en conidios expuestos a la radiación sobre una superficie inerte, placa Petri, que cuando la irradiación se produce sobre el insecto, una vez realizado el tratamiento. A este respecto, la disminución de la viabilidad de los conidios debido a la exposición a la radiación UV-B no es suficiente para evitar que un número viable de conidios restantes supere el umbral para comenzar el proceso patogénico. 8.- El tiempo de exposición a 1.200 mW m-2 de adultos de C. capitata tratados con la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum para reducir un 50% la mortalidad es de 47.2 horas, mientras que el tiempo necesario para reducir la viabilidad de conidios un 50% a la misma intensidad de radiación es 5.6 horas, lo que podría indicar que cuando la viabilidad de los conidios comienza a bajar, la fase de pre-penetración del hongo en el insecto ya ha comenzado, junto con el proceso patogénico, de ahí que la virulencia no se vea afectada en la misma proporción que la viabilidad de conidios. 4. Bibliografía. Foley, J. A., Ramankutty, N., Brauman, K. A., Cassidy, E. S. Gerber, J. S., Johnston, M., Mueller, N. D., O’Connell, C., Ray, D. K., West, P. C., Balzer, C., Bennett, E. M., Carpenter, S. R., Hill, J., Monfreda, C., Polasky, S., Rockström, J., Sheehan, J., Siebert, S., Tilman, D., Zaks, D. P. M., 2011. Solutions for a cultivated planet. Nature 478: 337-342 Lacey, L. A., 2017. Entomopathogens used as microbial control agents. En: Lacey, L. (Eds.), Microbial control of insect and mite pests. Academic Press, Yakima, WA, USA, pp 3-12 Meyling, N.V., Eilenberg, J., 2007. Ecology of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in temperate agroecosystems: potential for conservation biological control. Biological Control 43: 145-55 Popp, J., Pető, K., Nagy, J., 2013. Pesticide productivity and food security. A review. Agronomy for Sustainable Development 33: 243-255 Quesada-Moraga, E., 2013. Tendencias en sanidad vegetal. Nuevas y sorprendentes aplicaciones de los hongos entomo patógenos en sanidad vegetal. Phytoma, España 250: 72-73 Vega, F. E., Goettel, M. S., Blackwell, M., Chandler, D., Jackson, M. A., Keller, S., Koike, M., Maniania, N. K., Monzon, A., Ownley, B. H., Pell, J. K., Rangel, D. E. N., Roy, H. E., 2009. Fungal entomopathogens: new insights on their ecology. Fungal Ecology 2: 149-159