Desarrollo y evaluación de estrategias analíticas para la caracterización de compuestos bioactivos en alimentos funcionales

Resumen

Un alimento se define como funcional si posee efectos beneficiosos en una o más funciones fisiológicas del ser humano, incrementa su salud y/o disminuye el riesgo de padecer ciertas enfermedades. Normalmente la funcionalidad de un alimento está relacionada con algunos de los compuestos bioactivos que contiene. Entre ellos destacan los compuestos fenólicos, por ser en gran medida responsables de las características organolépticas de los alimentos procedentes de las plantas y, además, porque la ingesta de alimentos que los contienen está asociada con efectos beneficiosos, exhibiendo un amplio rango de propiedades fisiológicas. Por tanto, un conocimiento detallado de estos compuestos en los alimentos contribuirá, por un lado, a la caracterización del producto alimenticio que lo contiene, y por otro, a entender mejor sus efectos sobre la salud. En muchas ocasiones se trata de componentes en concentraciones muy pequeñas, por lo que son necesarias técnicas analíticas sensibles, selectivas y con gran capacidad de resolución. La presente memoria de tesis doctoral, titulada "Desarrollo y evaluación de estrategias analíticas para la caracterización de compuestos bioactivos en alimentos funcionales", trata sobre el desarrollo y la evaluación de metodologías de utilidad en las distintas etapas del proceso analítico para llevar a cabo la determinación de dichos compuestos minoritarios de interés en matrices alimenticias. La memoria se ha dividido en dos secciones principales: introducción y sección experimental, que incluye los resultados obtenidos y la discusión de los mismos. En la introducción se describen las características y propiedades más destacadas de los alimentos funcionales y los compuestos bioactivos, y más concretamente, de los compuestos fenólicos, así como las técnicas que se utilizan para su determinación, haciendo especial hincapié en las herramientas analíticas desarrolladas y evaluadas: síntesis de polímeros de impronta molecular (MIPs), técnicas separativas (HPLC y CE) y sistemas de detección (DAD y MS). La parte experimental consta de cuatro bloques temáticos, relacionados con las estrategias que se han empleado en las distintas etapas del proceso analítico (extracción, separación y detección). El bloque temático I versa sobre el desarrollo de MIPs para la extracción selectiva de compuestos fenólicos; en el único capítulo que incluye este bloque (capítulo 1), se describe la síntesis y caracterización de un MIP como fase adsorbente selectiva para hidroxitirosol (HTY) en extracciones en fase sólida (SPE). El MIP se sintetizó mediante una polimerización radicalaria en disolución, usando HTY como molécula molde y, a la vez que el MIP, se sintetizó el correspondiente NIP (polímero no impreso de control, sintetizado en las mismas condiciones pero en ausencia de molécula molde), necesario para demostrar el efecto de impronta y determinar la selectividad del MIP. La caracterización de los sitios de unión del MIP se llevó a cabo mediante estudios de distribución de afinidad. Para ello, se realizaron experimentos en "batch" utilizando dos disolventes de distinta polaridad y los datos experimentales se ajustaron al modelo de isoterma de adsorción de Freundlich, a partir del cual se calcularon las constantes de afinidad y la densidad de los sitios de unión. Posteriormente, se evaluó la selectividad del MIP hacia la molécula molde mediante un proceso de SPE, utilizando ocho compuestos fenólicos relacionados estructuralmente con el HTY, y cuatro disolventes de distinta polaridad para realizar las etapas de carga y de lavado. Ambos estudios permitieron demostrar la existencia del efecto de impronta. Finalmente, se compararon las capacidades de extracción del MIP y de un cartucho Diol comercial, siendo el primero capaz de retener mayores cantidades tanto de hidroxitirosol y de tirosol. Al final del bloque I se incluye un anexo con todos los polímeros sintetizados empleando diferentes técnicas de polimerización y condiciones de síntesis, y utilizando otras moléculas molde (catecol, tirosol, ácido 3,4-dihidroxifenilacético y ácido 3-(3,4-dihidroxifenil)propanoico). La parte de desarrollo y síntesis de los polímeros se llevó a cabo en el Departamento de Química Pura y Aplicada de la Universidad de Strathclyde de Glasgow (Reino Unido) mientras que su evaluación fue realizada en el Departamento de Química Analítica de la Universidad de Granada. En los dos siguientes bloques temáticos se describe la aplicación de métodos analíticos avanzados para la caracterización de compuestos bioactivos en distintas matrices: el bloque II se centra en la identificación de compuestos fenólicos en propóleo mediante CE-ESI-MS, mientras que el bloque III lo hace en la identificación de distintas clases de metabolitos y la cuantificación de compuestos fenólicos en tomate mediante HPLC-DAD-ESI-MS. El bloque temático II consta de dos capítulos. En el primero de ellos (capítulo 2) se recogen y resumen los métodos analíticos publicados hasta 2006 para la determinación de compuestos fenólicos en dos productos procedentes de la colmena, el propóleo y la miel. La calidad y las propiedades de dichos productos van a depender de su composición química, que a su vez depende del clima y del origen geográfico y floral de la zona donde las abejas realizan la recolección; de hecho, ciertos compuestos fenólicos podrían usarse como marcadores del origen floral de ambos productos. El tercer capítulo describe la optimización de un método CZE-ESI-MS para el análisis de compuestos fenólicos en extractos de propóleo; se estudiaron tanto los parámetros que afectan a la separación electroforética como los que afectan a la intensidad de la señal MS. El uso de un analizador de masas TOF permitió la identificación de doce flavonoides comparando las fórmulas moleculares obtenidas a partir de los datos de masa exacta con los datos en bibliografía. Los compuestos identificados presentan actividad biológica y, por tanto, se pueden considerar responsables en parte de las propiedades beneficiosas del propóleo sobre la salud. Siguiendo la sistemática anterior, el bloque temático III se ha dividido en dos capítulos. Así, el capítulo 4 recoge una revisión bibliográfica de los trabajos publicados entre 2000 y 2007 relativos al análisis de los compuestos antioxidantes presentes en tomate (carotenoides, vitaminas y compuestos fenólicos). La elección del método de análisis depende del objetivo del estudio y de los compuestos analizados, siendo HPLC la técnica más utilizada en el análisis de antioxidantes en tomate. En el quinto capítulo se emplea la HPLC como técnica separativa acoplada a distintos detectores, DAD y ESI-MS (con dos analizadores de masas diferentes, IT y TOF), para llevar a cabo la identificación de los metabolitos presentes en el extracto metanólico de tres variedades de tomate, Daniela, Rambo y Raf. Combinando la información obtenida mediante los diferentes detectores (tiempo de retención, espectros de absorbancia UV-vis, masa exacta, distribución isotópica y patrón de fragmentación, en polaridades negativa y positiva) y utilizando la bibliografía y las bases de datos existentes, se pudieron identificar tentativamente un total de 135 metabolitos pertenecientes a distintas familias de compuestos: aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleótidos, compuestos fenólicos, triterpenoides y ácidos grasos, 21 de los cuales, de acuerdo con la revisión bibliográfica realizada, no se habían identificado antes en el fruto del tomate. De todos ellos, los metabolitos más abundantes en el extracto fueron los compuestos fenólicos (61 en total), incluyendo alcoholes fenólicos, ácidos hidroxibenzoicos, hidroxicinámicos, fenilacéticos y flavonoides. El método, utilizando ESI-TOF en polaridad negativa, fue validado y empleado en la cuantificación de la fracción fenólica de las tres variedades; al no existir estándares comerciales para la mayoría de los compuestos identificados, se usaron como patrones compuestos pertenecientes a la misma familia. Se hizo así una estimación de la abundancia de cada compuesto y familia en las distintas variedades, destacando en todas ellas los ácidos hidroxicinámicos (30 identificados, siendo los más abundantes el ácido cafeoilquínico con sus distintos isómeros); con respecto a los flavonoides, la mayoría pertenece a la familia de los flavonoles (en concreto, derivados de la quercetina). Los mayores niveles de compuestos fenólicos se detectaron en la variedad Daniela. El último bloque temático consta de un capítulo en el que se aborda la construcción de una base de datos de espectros de masas (MS) y masas/masas (MS/MS) de compuestos fenólicos mediante HPLC-ESI-QqTOF para la detección automática e identificación robusta de dichos compuestos, facilitando y agilizando así esta última etapa del proceso analítico, que puede resultar un trabajo largo y tedioso. El analizador Q-TOF proporciona exactitud de masa y distribución isotópica verdadera tanto en el espectro MS como en el de MS/MS, siendo una herramienta muy adecuada para la identificación y elucidación estructural de compuestos. Para demostrar la potencialidad del método automático desarrollado se analizaron algunos de los ingredientes de origen vegetal de un complemento alimenticio (propóleo, cebolla, ajo o limón, entre otros). A pesar del limitado número de compuestos introducidos en la base de datos (un total de 39) pudieron identificarse con éxito diversos compuestos en los extractos estudiados. Este sexto capítulo también contiene un estudio relativo a los patrones de fragmentación en polaridad negativa de los compuestos fenólicos incluidos en la base de datos. La discusión acerca de los patrones de fragmentación en polaridad positiva se recoge en un anexo, ya que debido a su extensión, no se incluyeron en el trabajo publicado. El estudio de las fragmentaciones facilitará la identificación de compuestos desconocidos que no se hayan incorporado a la base de datos. El trabajo experimental de este bloque fue realizado durante una estancia en la empresa Bruker Daltonik GMBH en Bremen, Alemania.