Glutatión reductasa de "Phycomyces blakesleenus"purificación, caracterización y estudio del mecanismo cinético

  1. MONTERO FERNANDEZ M. SOL
Supervised by:
  1. María Dolores de Arriaga Giner Director

Defence university: Universidad de León

Year of defence: 1989

Committee:
  1. José María Medina Jiménez Chair
  2. Ángel Reglero Chillón Secretary
  3. Juan Luis Serra Ferrer Committee member
  4. Vicente Rubio Zamora Committee member
  5. María Jesús Llamas Fontán Committee member

Type: Thesis

Teseo: 21254 DIALNET

Abstract

Se ha purificado la glutacion reductasa de phycomyces blakesleeanus nrrl 1555 (-) a homogeneidad electroforetica; obteniendose una purificacion de 7650 veces, con un rendimiento del 36%. La enzima muestra el espectro de absorcion tipico de una flavoproteina con fad como grupo prostetico. La glutation reductasa nativa es un dimero (mr 100.000) constituido por dos subunidades identicas (mr 50.000), con una molecula de fad por subunidad. La enzima utiliza preferentemente nadph como donador de electrones, el ph optimo con este nucleotido de 7.5. Los patrones cineticos obtenidos a ph 7.5 son consistentes con un mecanismo ramificado, que incluye un mecanismo ping-pong con formacion de un complejo abortivo f-nadph, operativo a concentraciones bajas de gssg, y un mecanismo secuencial ordenado, predominante a concentraciones altas de sustrato. A valores de ph inferiores a 7.5, la enzima muestra ademas inhibicion por gssg, independiente de la concentracion de nadph. En el rango de ph acidos, la enzima muestra un comportamiento aparentemente histeretico, exhibiendo un lag en las curvas de progreso de las reacciones enzimaticas, que parece requerir la presencia de los dos sustratos. La constante de velocidad de la transicion (k) disminuye al incrementarse la concentracion de ambos sustratos y aumenta a medida que se incrementa la concentracion de enzima, el ph y la fuerza ionica. A bajas concentraciones, gsh y nadp+ ejercen un efecto activador mas acusado sobre la velocidad inicial. Los resultados sugieren que este aparente comportamiento histeretico pudiera ser debido a un fenomeno de activacion originado por la acumulacion de los productos de la reaccion con el tiempo.