Caracterización genética y molecular de los mutantes venosa y denticulata de arabidopsis thaliana

Resumen

Con el fin de contribuir a la disección genética del desarrollo foliar en las plantas, hemos estudiado en esta Tesis varias mutaciones que perturban propiedades locales de la morfología de las hojas de Arabidopsis thaliana. En las hojas de los mutantes reticulados la venación se distingue claramente por su coloración verde, que destaca sobre un limbo pálido. Este rasgo fenotípico ha sido utilizado anteriormente en el laboratorio de J.L. Micol como indicador externo de la existencia de alteraciones en la proliferación de los tejidos intervenales internos. Estos mutantes reticulados fueron agrupados inicialmente en la clase Venosa (Ven), que incluye 6 grupos de complementación, dos de los cuales han sido estudiados en esta Tesis: VEN1 y VEN3. El grupo de complementación VEN3 incluye 4 alelos semidominantes que reducen el tamaño de las células e incrementan los espacios intercelulares del mesófilo. Hemos realizado un análisis metabolómico de las hojas de los mutantes ven3, que ha evidenciado la acumulación de ornitina y un déficit de arginina. Hemos clonado posicionalmente el gen VEN3, concluyendo que codifica la subunidad grande de la carbamoil fosfato sintetasa (CPS), que cataliza en otras especies la conversión de glutamina en glutamato y carbamoil fosfato (CP). El CP se condensa con la ornitina para dar lugar a citrulina en la ruta de biosíntesis de la arginina. La suplementación del medio de cultivo con estos metabolitos evidenció que los mutantes ven3 son más sensibles que el tipo silvestre a la inhibición del crecimiento causada por la ornitina y que la citrulina suprime su fenotipo morfológico. Nuestros resultados indican que la actividad CPS y la arginina son particularmente necesarias para el desarrollo del mesófilo intervenal -pero no para las venas y las células perivasculares- en las hojas de Arabidopsis thaliana. La expresión heteróloga del gen VEN3 en mutantes de Escherichia coli deficientes en la actividad CPS nos ha permitido demostrar su actividad enzimática, así como que su función está conservada entre estas dos especies tan distantes. También hemos clonado posicionalmente el gen VEN1, concluyendo que codifica la subunidad alfa de la antranilato sintasa, que cataliza la primera etapa de la ruta de biosíntesis del triptófano. El mesófilo de los mutantes ven1 contiene células más grandes y más espacios aéreos que el tipo silvestre. Serán necesarios más estudios del gen VEN1 para desentrañar su papel en el desarrollo foliar. Hemos estudiado los mutantes denticulata (den), que presentan hojas apuntadas con márgenes indentados. La clase fenotípica Den incluye 30 grupos de complementación, y es por ello la más numerosa de las definidas en el laboratorio de J.L. Micol. Tal abundancia de mutantes den sugiere la alteración de algún proceso del desarrollo foliar en el que participan muchos productos génicos. Hemos clonado posicionalmente las mutaciones den5, den12, den29 y den30, concluyendo que son alelos de los genes que codifican las proteínas ribosómicas RPL7B, RPL10aB, RPL28A y RPL39C, respectivamente. Estos resultados nos han llevado a incluir en nuestro estudio, otros 21 mutantes de fenotipo similar -algunos de los cuales habían sido llamados pointed leaves (poi)- y también portadores de mutaciones en genes que codifican proteínas ribosómicas, casi todos los cuales presentaron una reducción apreciable del área del limbo. También manifestaron una disminución en el tamaño de las células pavimentosas de la epidermis y el número de las del mesófilo en empalizada. Los niveles de ploidía de las células de las hojas de estos mutantes indican que la división celular está disminuida y la endorreduplicación, incrementada. Estos resultados sugieren una reducción de la proliferación celular en las hojas de los mutantes a estudio. Hemos analizado también las interacciones genéticas de los mutantes den y poi con los asymmetric leaves1 (as1) y as2. La abaxialización foliar que caracteriza a los mutantes as se acentuó en los dobles mutantes den as y poi as, especialmente en los den as2-1. Todas las mutaciones en genes que codifican proteínas ribosómicas de Arabidopsis thaliana, tanto las estudiadas en el laboratorio de J.L. Micol como las analizadas por otros grupos, causan un fenotipo de hojas apuntadas y pequeñas e interaccionan sinérgicamente con as1 y as2. Estas características comunes podrían deberse a una alteración de la biosíntesis proteica causada por la disfunción del ribosoma, que tiene una manifestación fenotípica más clara en las hojas que en otros órganos. Sin embargo, hemos observado rasgos fenotípicos específicos en ciertos mutantes den y poi: mientras que algunos están alterados principalmente en la proliferación celular, otros lo están en la polaridad foliar, según indican los fenotipos de sus dobles mutantes con as1 y as2. Estos resultados sugieren que algunas proteínas ribosómicas tienen papeles específicos en determinados procesos de desarrollo. Son dos las observaciones que favorecen esta hipótesis: por un lado, que el número de genes de Arabidopsis thaliana cuyos productos son proteínas ribosómicas supera los 230, muchos más de los necesarios para codificar las 80 proteínas que forman parte del ribosoma citoplásmico; por otro, que dichos genes manifiestan patrones de expresión espacial y temporal diversos.