Efecto de la deguelina in vitro y en un modelo murino de leucemia linfoide crónica (llc)

Resumen

OBJETIVOS Principal: Evaluación de la acción sensibilizante de la deguelina en células de pacientes de LLC cultivadas in vitro y en un modelo murino de LLC in vivo. Específicos: 1. Estudio de la efectividad de la deguelina en comparación con otros inhibidores específicos de la vía PI3K/AKT en células de pacientes de LLC cultivadas in vitro en condiciones de actividad sostenida de la vía PI3K: 1.1. Como agente único: Caracterización molecular de su acción. 1.2. En combinación con agentes inductores de apoptosis en células de LLC: 2. Estudio de la efectividad de la deguelina como agente sensibilizante in vivo en un modelo murino de LLC. 2.1. Acción como agente único. 2.2. Eficacia de su utilización combinada con fludarabina. 2.3. Evaluación de su toxicidad. CONTROLES Y PACIENTES DE LLC Controles Se incluyeron muestras de sangre periférica de 17 donantes voluntarios sanos adultos. Pacientes de LLC Se incluyeron 35 muestras de sangre periférica de pacientes diagnosticados de LLC según criterios clínicos, fenotípicos e inmunológicos (Rozman y Montserrat, 1995; Hallek et al., 2008). Ningún paciente había recibido quimioterapia en un período de al menos tres meses previos al estudio. La edad media era de 71 años (en un rango comprendido entre 42 y 95 años) y entre ellos había un 31% de mujeres frente al 69% de hombres. La linfocitosis media de los pacientes en el momento del estudio era de 21267 células/µl (Tabla 2). Las muestras procedían del Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda y del Hospital Universitario de la Paz en Madrid. AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES (CMN) De cada individuo se obtuvo una muestra de diez centímetros cúbicos de sangre venosa en tubos Venoject con 150 unidades (U) de heparina de litio (Terumo Europe N.V., Leuven, Bélgica). La obtención de las CMN de sangre periférica se llevó a cabo diluyendo la sangre venosa 1:1 con tampón fosfato salino (PBS, Amresco, Solon, OH, USA), mediante centrifugación a 350 g durante 30 min a T ambiente en un gradiente de densidad (Comercial Rafer SL, Zaragoza, España) (Bøyum, 1976). Se recogió la fase que contenía las CMN (linfocitos, monocitos y células asesinas naturales) y se lavó 3 veces con PBS. En el caso de los pacientes las suspensiones de CMN contenían entre un 90 y un 95% de linfocitos B. La viabilidad y la concentración celular se valoraron mediante tinción con el colorante de exclusión vital azul tripán (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) y contaje por microscopía directa (Carl Zeiss, Oberkoche, Alemania), utilizando una cámara de Neubauer. Las CMN se ajustaron en RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies Inc., Rockville, MD,USA ) a la concentración de trabajo. INMUNOFENOTIPO Marcaje directo de moléculas de superficie Las distintas poblaciones celulares se identificaron utilizando varias combinaciones de anticuerpos monoclonales específicos. Para ello se empleó la técnica de inmunofluorescencia directa y posterior análisis en un citómetro de flujo FACSort con el programa CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA, USA). Se preincubaron 3 x 105 CMN con 50 µl de suero de ratón (Chemicon, Millipore, CA, USA) durante 5 min para bloquear las uniones inespecíficas y a continuación se marcaron con 2,5-5 ¿l de cada uno de los anticuerpos (Tabla 3) y se incubaron 20 min en oscuridad. Transcurrido ese tiempo se lavaron dos veces con PBS y se analizaron en el citómetro de flujo. Marcaje intracelular directo Partiendo de 1 x 106 de CMN de LLC, se añadieron 50 µl de suero de ratón durante 5 min. Después las células se incubaron durante 20 min en oscuridad con anticuerpos dirigidos contra moléculas de superficie para discriminar las distintas poblaciones linfocitarias: CD19 CD3 y CD56 (Tabla 3), se lavaron y a continuación se fijaron a T ambiente durante 20 min con 100 µl del reactivo A de un kit de fijación y permeabilización celular (Fix & Perm kit , Invitrogen, Grand Island, NY,USA). Después de un lavado con PBS se añadieron 100 µl del reactivo B junto con 2 µl del anticuerpo anti-ZAP70 o F-Actina (Molecular Probes®, Life Technologies Inc., Rockville, MD,USA) (Tabla 3), y se incubaron 20 min a T ambiente y en oscuridad. Transcurrido este tiempo y tras un último lavado, se analizaron por citometría de flujo. ENSAYOS FUNCIONALES Y CONDICIONES DE CULTIVO CMN En todos los ensayos realizados, las CMN se cultivaron en medio completo, RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) descomplementado o de plasma autólogo, 2 mM de L-glutamina y con una mezcla de antibiótico (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml), todos ellos suministrados por Gibco, a 37 ¿C con 5% de CO2 y humedad controlada. Líneas celulares La línea murina de fibroblastos obtenida por transfección estable de la línea L929 con el receptor de Fc de CD32, LTK, (ATCC, Rockville, MD, USA), se cultivó en medio completo a 37 ¿C con un 5% de de CO2 y humedad controlada hasta la confluencia, realizándose pases del cultivo cada 3-5 días mediante el uso de tripsina. Para inhibir su crecimiento durante los ensayos de cocultivo se trató a la monocapa con mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO, USA), para ello se tripsinizaron las células una vez alcanzada la confluencia, se lavaron y se resuspendieron en RPMI 1640, a una concentración de 2-4 x106 células/ml y se incubaron con mitomicina C (50 ¿g/ml) durante 30 min a 37 ¿C. Después de 3 lavados, las células LTK se sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 104 células por pocillo) y se dejaron durante 12 horas para permitir su adherencia al plástico y la formación de la monocapa confluente. Citotoxicidad de la deguelina como agente único o en combinación con otros fármacos Las CMN (1 x 106 células/ml) se cultivaron con medio completo en presencia o ausencia de la monocapa de fibroblastos murina LTK y en presencia de distintas concentraciones de deguelina. En los ensayos de combinación de fármacos se preincuparon durante 1 h con distintas concentraciones de deguelina (Tocris Biosciences, Bristol, UK) y, a continuación, se cultivaron con los diferentes agentes farmacológicos (Fludarabina (F-ara-A), Doxorrubicina, Clorambucil y Rapamicina (todos suministrados por Sigma)) durante 24 o 48 horas siempre en una proporción constante con la deguelina, indicada en cada ensayo. En la condición control las CMN se cultivaron con el vehículo en el que iban disueltos los fármacos (RPMI con DMSO, de forma que la concentración de DMSO en los cultivos nunca superó el 0.1%). Como control de sinergia se realizó un ensayo de combinación entre el ácido valproico (Sigma) y TRAIL (Alexis, Bringham, UK) (Lagneaux et al., 2007), preincubando las células durante 30 min con ácido valproico y a continuación incorporando TRAIL en una ratio 20:1. Estudio de la interacción entre fármacos El procedimiento de estudio de la sinergia y el índice de combinación entre dos drogas se basa en una ecuación derivada por Chou (Chou, 2006) a partir de modelos enzimáticos cinéticos y en la construcción de representaciones gráficas llamadas isobologramas. Para el cálculo de estos parámetros se utilizó el programa CalcuSyn© (Biosoft, Cambridge, UK). Brevemente, los isobologramas (Fig. 3) son representaciones gráficas en un eje de coordenadas de las dosis equiefectivas de dos o más fármacos, que son aquellas necesarias para conseguir un determinado efecto o ¿fracción de células afectadas¿. En cada uno de los ejes se representa la dosis equiefectiva de uno de los fármacos que se estudian (Da y Db) respectivamente. Estos dos puntos se unen mediante una línea (isobolo) que también se conoce como línea de aditividad o de no interacción. A continuación, se representa el valor de dosis de la combinación de ambos (da, db), que es equiefectiva con las dosis individuales de los fármacos.