Estudio de gins, un nuevo complejo vitaminico esencial para la replicacion del genoma humano

Abstract

GINS es un complejo heterotetramétrico conservado evolutivamente en los organismos eucariotas, formado por las proteínas Sld5 (Synthetic Lethal with Dpb 11-5), Psf1, Psf2 y Psf3 (Partnerse os Sld five-1, 2, 3). Fue inicialmente descrito en levaduras como un complejo esencial para el proceso de replicación del ADN. La presente memoria de tesis doctoral se centra en la caracterización del ortólogo humano del complejo GINS y en su papel en la replicación del ADN en células humanas. En primer lugar procedimo a la clonación de las cuatro subunidades y a la expresión y purificación y del complejo recombinante en el sistema bacteriano de E.coli. Utilizando como antígeno la proteína purificada, se prepararon anticuerpos específicos contra cada una de sus subunidades. La purificación del complejo permitió la realización de ensayos de retraso de movilidad electroforética que indicaron la capacidad de hGINS de interaccionar con moléculas de ADN, mostrando preferencia por sustratos de cadena sencilla. Asimismo, en colaboración con el Grupo de Cristalografía de Macromoléculas, dirigido por el Dr. Guillermo Montoya se realizó un estudio estructural mediante la combinación de microscopía electrónica y espectrometría de masas que reveló la arquitectura del complejo. De acuerdo con nuestro estudio las subunidades de hGINS estarían dispuesas en forma de C dejando una cavidad central en la cual podría acomodarse una molécula de ADN de cadena sencilla o incluso de cadena doble. La obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales permitió realizar una caracterización del complejo GINS en células humanas en cultivo. GINS es expresado en células en proliferación y sus niveles son constantes a lo largo del ciclo celular. En células quiescentes la expresión de GINS cesa y sus niveles se reducen rápidamente sugiriendo que se trata de un factor asociado a la proliferación celular activa. La depleción de GINS en células HeLa mediante RNA interferente provoca la acumulación de células en la transición de la fase G1 a S, la acumulación de daño en ADN y la activación del mecanismo checkpoint mediado por la proteína kinasa Chk1. Mediante ensayo de inmunoprecipitación en extractos de fracciones enriquecidas en cromatina, se pudo demostrar la interacción de GINS, Mcm2-7 y Cdc45 indicando la existencia de un complejo ternario Cdc45:Mcm2-7:GINS (CMG) en células humanas, propuesto como helicasa replicativa. Por último presentamos un estudio acerca de la localización de GINS y Mcms en el núcleo de células humanas durante el proceso de replicación de ADN y proponemos un modelo que explica la denominada paradoja de las Mcms. En conjunto los resultados de esta tesis añaden más conocimiento al estudio del papel de las proteínas GINS y Mcm2-7 en el proceso de la replicación del ADN en células humanas.