Estudio de la expresión de enzimas del metabolismo de aminoácidos en lactococcus lactis

Resumen

Los aminoácidos son fundamentales para la supervivencia y el desarrollo de bacterias. Son las principales fuentes de nitrógeno y están implicados en la producción de energía, el control del pH intracelular y la regeneración de cofactores. Además, son los precursores de una larga variedad de compuestos volátiles en Lactococcus lactis, y por ello, diversas enzimas son consideradas clave para su formación, como aminotransferasas, deshidrogenasas, liasas y decarboxilasas, entre otras. Estas enzimas están reguladas por diferentes mecanismos en respuesta a la disponibilidad de sustratos, así como por sistemas de regulación globales que actúan a nivel transcripcional. En este sentido, los aminoácidos de cadena ramificada (BCAAs) parecen tener un papel regulatorio clave en L. lactis, ya que son esenciales para la síntesis de proteínas, además de actuar de precursores de importantes compuestos volátiles. La presencia de ciertas enzimas no garantiza un determinado impacto en el aroma, por lo que se considera necesario estudiar el nivel de actuación de esas enzimas para conseguirlo, abordando estudios sobre su expresión que integren las observaciones fenotípicas con los análisis genómicos y transcriptómicos. Sólo así se podrá conocer la diversidad intra e interespecie existente en las bacterias lácticas. El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la influencia de diversos mecanismos de regulación en la expresión de enzimas del metabolismo de aminoácidos y su relación en el control de la formación de compuestos volátiles en L. lactis. Basados en la capacidad que presentan las estirpes naturales de L. lactis para crecer con bajos requerimientos nutricionales, sobre todo de aminoácidos, se estudió en L. lactis IFPL730 el efecto del contenido en BCAAs en el medio de crecimiento sobre la expresión de genes que están relacionados con la conversión de aminoácidos y la formación de compuestos del aroma (araT, bcaT, kivD, ytjE y panE) por transcripción inversa y PCR a tiempo real, y la formación de esos compuestos volátiles por SPME y GC-MS. La carencia o ausencia de BCAAs en el medio de crecimiento determinó cambios en la expresión de esos genes probablemente asociados al mecanismo de regulación mediado por el regulador global del metabolismo del nitrógeno CodY. Los cambios genéticos en esas condiciones de crecimiento repercutieron en el perfil de compuestos volátiles detectados durante el crecimiento de L. lactis IFPL730 Con objeto de caracterizar la respuesta en el metabolismo de aminoácidos de L. lactis a la carencia de isoleucina en el medio de crecimiento se realizó un estudio que abarcaba análisis genómicos y transcriptómicos. En primer lugar, el análisis genómico se realizó para investigar la organización del genoma de L. lactis IFPL730 mediante hibridación genómica comparativa (CGH) utilizando un microchip con los genomas de L. lactis IL1403 y L. cremoris SK11, que sirvieron para determinar diferencias en los patrones de expresión entre las estirpes. El análisis por CGH mostró la variabilidad genética existente entre tres cepas de L. lactis, revelando la diversidad de genes y regiones intergénicas. Además, con el análisis de la identidad de secuencia se comprobó que el genoma de L. lactis IFPL730 está más próximo al de L. lactis IL1403 que al de L. cremoris SK11. En segundo lugar, la respuesta a la carencia de isoleucina fue llevada a cabo mediante un estudio transcriptómico con microchips sobre dos cepas de L. lactis (IL1403 e IFPL730) en diferentes etapas del crecimiento. Se mostró una diversa variabilidad en la expresión de genes implicados en la hidrólisis de péptidos y el transporte de péptidos y aminoácidos en respuesta a la ausencia de isoleucina. También se estudió la expresión variable de genes involucrados en la biosíntesis de isoleucina en las dos estirpes y en diferentes estados celulares. Además, se observó la existencia de un complejo mecanismo que regulaba la carencia de isoleucina en L. lactis, implicando a varios reguladores y conectando el metabolismo del nitrógeno y del carbono. La región promotora del gen kivD de L. lactis IFPL730 posee dos presuntas secuencias consenso de promotores con polaridad divergente, una en dirección al gen kivD y la otra en la dirección opuesta delante de un operón compuesto por los genes rmaF y rlrC. Además, presenta una secuencia de reconocimiento para la unión con el regulador CodY (caja CodY) entre las regiones -10 y -35 del promotor PKivD, además de una secuencia repetida inversa cerca de la región -35 del promotor PRmaF-RlrC. Con objeto de caracterizar los mecanismos genéticos relacionados con la regulación de esta región promotora divergente se procedió a la fusión transcripcional de dicha región en un vector de expresión en L. lactis, que se construyó para la realización de este estudio con los genes que codifican las proteínas autofluorescente roja (mRFP) y verde (GFP), organizados en sentido divergente. Los resultados obtenidos han mostrado que los reguladores RmaF y RlrC reprimen la expresión de la región promotora del gen kivD en un mecanismo independiente del contenido en aminoácidos y péptidos en el medio de crecimiento. Se comprobó que la expresión de la región promotora del gen kivD dependía de la presencia de la secuencia de la caja CodY y de la secuencia repetida inversa. Además, ambas estructuras participan en la regulación por el regulador CodY mediada por el contenido en BCAAs en el medio de crecimiento