Caracterización bioquímica y funcional de la ADN polimerasa 4 de Schizosaccharomyces pombe

Resumen

ÍNDICE............................................................................................................. 1 ABSTRACT..................................................................................................... 5 INTRODUCCIÓN............................................................................................. 7 1. Las ADN polimerasas.................................................................................................... 7 2. Mantenimiento de la estabilidad genómica............................................................... 9 3. Sistemas de reparación del daño en el ADN.............................................................. 10 3.1. Reparación por escisión de base (BER).............................................................. 10 3.1.1. Polß: un modelo de ADN polimerasa de reparación.............................. 13 3.2. Reparación por escisión de nucleótido (NER).................................................. 15 3.3. Reparación de apareamientos erróneos (MMR)............................................... 16 3.4. Reparación de roturas de doble cadena en el ADN......................................... 16 3.4.1. Mecanismos de recombinación homóloga (HR)...................................... 17 3.4.2. Mecanismos de unión de extremos no homólogos (NHEJ).................... 19 4. Mecanismos de tolerancia al daño en el ADN........................................................... 21 5. Schizosaccharomyces pombe: Modelo de organismo eucariota................................... 22 OBJETIVOS..................................................................................................... 25 MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................... 27 1. Identifi cación de la ADN polimerasa 4 de S. pombe.................................................. 27 2. Análisis fi logenético....................................................................................................... 27 3. Material biológico.......................................................................................................... 27 3.1. Cepa de Escherichia coli......................................................................................... 27 3.2. Cepas de Schizosaccharomyces pombe................................................................... 27 3.3. Cepas de Saccharomyces cerevisiae........................................................................ 28 4. Vectores de expresión.................................................................................................... 28 5. Medios de cultivo........................................................................................................... 29 5.1. Medios de cultivo para E. coli.............................................................................. 29 5.2. Medios de cultivo para S. pombe.......................................................................... 29 5.3. Medios de cultivo para S. cerevisiae..................................................................... 30 6. Enzimas, reactivos, nucleótidos y oligonucleótidos.................................................. 30 6.1. Enzimas................................................................................................................... 30 6.2. Reactivos................................................................................................................. 30 6.3. Nucleótidos............................................................................................................. 30 6.4. Oligonucleótidos.................................................................................................... 30 7. Métodos de transformación celular............................................................................. 32 7.1. Transformación de E. coli...................................................................................... 32 7.2. Transformación de S. pombe.................................................................................. 32 8. Interrupción génica........................................................................................................ 33 9. Detección de moléculas de ADN o Southern blot....................................................... 33 10. Detección inmunológica de proteínas transferidas a membrana o Western blot. 33 11. Purifi cación de proteínas............................................................................................. 34 11.1. Purifi cación de la ADN polimerasa 4 de S. pombe........................................... 34 11.2. Purifi cación de la Pol¿ (Eso1) de S. pombe........................................................ 34 12. Mutagénesis dirigida por PCR................................................................................... 35 13. Preparación de extractos celulares totales................................................................ 35 14. Ensayo de actividad 3'5' exonucleasa................................................................... 35 Índice 2 15. Ensayo de actividad polimerasa................................................................................ 36 15.1. Ensayo de actividad polimerasa con ADN activado...................................... 36 15.2. Ensayo de actividad polimerasa dependiente de molde............................... 36 15.2.1. Análisis de procesividad............................................................................ 36 15.2.2. Análisis de fi delidad en moléculas que contienen un hueco de un núcleotido con un grupo fosfato en 5'................................................................. 36 15.2.3. Análisis de incorporación de rNTPs........................................................ 37 15.2.4. Análisis de incorporación de rNTPs en un sustrato tipo molde/ cebador abierto........................................................................................................ 37 15.2.5. Ensayo de polimerización independiente de molde (actividad transferasa terminal).............................................................................................. 37 15.2.6. Análisis de dislocación mediada por deslizamiento............................. 38 15.2.7. Análisis de dislocación mediada por la selección de dNTP................. 38 15.2.8. Análisis de recolocación del cebador....................................................... 38 15.2.9. Análisis de la capacidad de desplazar banda e incorporar dNTPs..... 39 15.2.10. Análisis de inserción frente a la base modifi cada 8-oxoG................... 39 15.2.11. Análisis de extensión desde pares cuya base molde es 8-oxoG......... 39 16. Ensayos de retraso en gel (EMSA)............................................................................. 40 17. Ensayo de actividad desoxirribosafosfato liasa (dRP liasa).................................... 40 18. Ensayo de reducción con NaBH4............................................................................... 41 19. Ensayo de reparación por escisión de base.............................................................. 41 20. Ensayo de actividad AP liasa..................................................................................... 41 21. Análisis genético de la sensibilidad a agentes genotóxicos mediante test de gota...................................................................................................................................... 41 22. Análisis genético de la sensibilidad a MMS mediante cuvas de viabilidad........ 42 23. Sincronización de S. pombe en la fase G1 del ciclo celular mediante la eliminación del N2 del medio........................................................................................... 42 24. Análisis genético de la sensibilidad a IR mediante curvas de viabilidad............ 42 25. Análisis de la frecuencia de mutación espontánea e inducida (Ensayo de resistencia a canavanina)................................................................................................... 42