Effect of chitosan on fungal physiologyrole of Pochonia chlamydosporia chitosanases and chitin deacetylases in nematode parasitism and bioethanol production

Resumen

Unos de los principales objetivos de esta Tesis Doctoral es estudiar el papel del quitosano en la fisiología de la pared celular de los hongos así como, en el proceso de infección de huevos de nematodo por el hongo nematófago Pochonia chlamydosporia. El quitosano permeabiliza la membrana plasmática de hongos sensibles a este compuesto. La pared celular de los hongos está íntimamente ligada a la membrana plasmática percibiendo estreses ambientales. Sin embargo, el papel de la pared celular en la respuesta a quitosano no se ha estudiado. Las estrategias tróficas de los hongos se pueden estudiar mediante el análisis de las enzimas activas sobre carbohidratos (CAZymes). La presencia de quitosanasas en el genoma de P. chlamydosporia podría explicar la resistencia de este hongo a quitosano. Sin embargo, el papel de estas enzimas, así como de las quitín desacetilasas (CDAs) de este hongo no se ha estudiado en detalle. Además, no se ha confirmado la actividad de las quitín desacetilasas predichas in silico tras la anotación del genoma de P. chlamydosporia. Tampoco se ha analizado la capacidad degradativa de quitosano de los hongos parásitos de invertebrados (P. chlamydosporia, Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana) para producir azúcares reductores que puedan ser fermentados a etanol. El objetivo principal de esta Tesis se puede subdividir en los siguientes objetivos específicos: • Evaluar el papel del dinamismo y de la composición de la pared celular fúngica en la respuesta de los hongos a quitosano. • Anotar las CAZymes codificadas en el genoma de Pochonia chlamydosporia, especialmente centrándose en el papel de las enzimas modificadoras de quitina y quitosano en la infección de huevos de nematodos. • Expresar y analizar la actividad de una quitín desacetilasa (Pc_2566) predicha en la anotación del genoma de P. chlamydosporia. • Evaluar la capacidad de Pochonia chlamydosporia, Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana para producir etanol utilizando quitosano como materia prima. En esta Tesis Doctoral, se han utilizado un amplio rango de técnicas tanto para el estudio del papel de la pared celular en la respuesta a quitosano como para el estudio del papel de este polímero en el proceso de infección de huevos de nematodo por el hongo nematófago P. chlamydosporia. Debido a su actividad biológica, el quitosano ha ganado importancia en aplicaciones biotecnológicas, agriculturales e industriales (Dutta et al., 2004; Rinaudo, 2006). El quitosano posee propiedades antibacterianas y antifúngicas (Goy et al., 2016) pero es inocuo para las células humanas (Lopez-Moya et al., 2015). Respecto al modo de acción de este polisacárido, la membrana plasmática se ha propuesto como la principal diana de este compuesto (Zakrzewska et al., 2005; Palma-Guerrero et al., 2009; Lopez-Moya et al., 2015 y 2016). Además, los genes relacionados con la síntesis de ergosterol y proteínas unidas a GPI (glicosilfosfatidilinositol) son dianas moleculares del quitosano en la levadura S. cerevisiae (Jaime et al., 2012). La pared celular de hongos es una estructura clave en la fisiología fúngica debido a que es la interfaz entre los hongos y el ambiente de los mismos (Latgé y Beauveais, 2014). A pesar de las propiedades antifúngicas de este compuesto, se ha encontrado en la pared celular de Cryptococcus neoformans involucrado en el mantenimiento de la misma (Baker et al., 2007) y en la virulencia de este organismo (Baker et al., 2011). Además, el quitosano participa en la adhesión de los apresorios de Magnaporthe oryzae (Geoghegan y Gurr, 2016). En vista del potencial del quitosano en micología clínica (Kulikov et al., 2014) y teniendo en cuenta el nexo entre la membrana plasmática y la pared celular, en el Capítulo 1 se ha estudiado el papel de la pared celular en la respuesta de los hongos a quitosano. La arquitectura y composición de dicha estructura es variable y, este dinamismo está relacionado con la resistencia a antifúngicos y virulencia (Reese et al., 2007; Ene et al., 2012). De entre los resultados obtenidos, se ha visto que la regeneración de la pared celular a partir de protoplastos, protege a estas estructuras del daño causado por el quitosano. Este resultado indica que una pared celular ensamblada correctamente es esencial para la resistencia a quitosano. Debido a que la pared celular responde a cambios ambientales como la falta de nutrientes (Hall, 2015) y que previos estudios ha relacionado la actividad del quitosano con la limitación de nutrientes (Lopez-Moya et al., 2015), es posible que las modificaciones de la pared celular causadas por la falta de nutrientes sean, al menos en parte, resposables del daño causado a las células. Algunos compuestos antifúngicos bloquean o reducen la síntesis y/o ensamblaje de los compuestos que forman parte de la pared celular (Ghannoum y Rice, 1999). Existe un número limitado de antifúngicos efectivos en el tratamiento de infecciones fúngicas serias (Watanabe et al., 2012). Un conocimiento más extenso de la complejidad de la pared celular de patógenos fúngicos evitará la creciente emergencia de resistencias a los antifúngicos comúnmente utilizados en la práctica clínica. Las equinocandinas, por su parte, bloquean la síntesis de β-1,3 glucanos de la pared celular fúngica (Bal, 2010). En particular, la caspofungina es un potente antifúngico que inhibe la enzima β-(1,3)-glucano sintasa (Letscher-Bru, 2003). En este capítulo, hemos encontrado que la caspofungina y el quitosano inhiben el crecimiento fúngico de forma sinérgica. Este hecho podría ser el resultado del efecto combinado de la caspofungina inhibiendo la síntesis de glucanos de la pared y del quitosano que permeabiliza la membrana plasmática (Palma-Guerrero et al., 2009). Otros resultados describen el efecto sinérgico de COS en combinación con el fluconazol, que poseen la membrana plasmática como diana común (Jaime et al., 2012). El quitosano tiene efecto antifúngico contra patógenos humanos como Aspergillus fumigatus y Rhizopus stolonifer (Lopez-Moya et al., 2015) mientras que la caspofungina se ha utilizado ampliamente en terapias contra Aspergillus fumigatus y Candida albicans (Letscher-Bru, 2003). Nuestros resultados podrían favorecer el desarrollo del quitosano como antifúngico, por sí solo o en combinación con antifúngicos de uso común como azoles o equinocandinas para disminuir la resistencia a estos compuestos mediante la diversificación de las dianas de acción de los mismos y/o reduciendo las dosis necesarias para un tratamiento efectivo. A lo largo del Capítulo 1, se ha visto además que el quitosano reprime la expression de genes relacionados con la síntesis y elongación de glucanos de la pared celular, como fks y gel-1. El gen fks codifica el dominio catalítico de la β-1,3-glucano sintasa (Douglas, 2001) que está regulado por la GTPasa RHO1 (Richthammer et al., 2012). Esta GTPasa es el mayor regulador de vía de integridad de la pared celular (CWI) (Levin, 2011). Por su parte, gel-1 codifica para una glucanosiltransferasa relacionada con la elongación de glucanos en la pared celular (Kamei et al., 2013). Los resultados de este capítulo sugieren que el quitosano modifica la síntesis de los glucanos de la pared celular. Existen resultados previos que apoyan también que este polímero modula la vía CWI en S. cerevisae (Zakrzewska et al., 2005) y reprime el gen rho-1 en N. crassa (Lopez-Moya et al., 2016). La disposición de β-1,3-glucanos y quitina (Free, 2013) que componen la pared celular modifica las propiedades de esta estructura (Lenardon et al., 2010). La quitina es un polímero lineal que proporciona soporte y resistencia a la pared celular fúngica a diferencia de glucanos, que son polímeros ramificados que confieren flexibilidad y consistencia (Free, 2013). En este capítulo, hemos encontrado que una baja proporción de glucanos en la pared celular (ramificación baja) confiere a los hongos sensibilidad a quitosano. P. chlamydosporia es un hongo resistente a quitosano con una elevada proporción de β-1,3-glucanos respecto a la quitina de su pared celular. Esta elevada ramificación en los glucanos de la pared celular podría prevenir el contacto entre el quitosano y la membrana plasmática de los hongos, evitando su permeabilización. En este sentido, la composición y arquitectura de la pared celular podría explicar, en parte, la sensibilidad de los hongos filamentosos a este compuesto. Un estudio reciente en Staphylococcus aureus indica que la pared celular y la membrana plasmática pueden estar relacionadas con la unión del quitosano a la célula y por tanto, con su actividad (Raafat et al., 2017). Los hongos nematófagos y entomopatógenos utilizados como ACB son resistentes a quitosano (Palma-Guerrero et al., 2008). Este polímero, además, aumenta la esporulación y la actividad quitinolítica y quitosanolítica de P. chlamydosporia (Palma-Guerrero et al., 2008 y 2010b). En esta Tesis Doctoral, hemos analizado el papel del quitosano en la infección de huevos de nematodo por P. chlamydosporia. Pochonia chlamydosporia es un hongo nematófago (Kerry, 2000; Verdejo-Lucas et al., 2002) con capacidades endofíticas (Bordallo et al., 2002) que beneficia a sus plantas huésped (Macià-Vicente et al., 2009; Zavala-Gonzalez et al., 2015). La reciente secuenciación del genoma de P. chlamydosporia ha supuesto una herramienta para la mejora del entendimiento de la ecología del hongo y del proceso de infección en particular (Larriba et al., 2014). Esto, incluye la identificación de posibles factores de virulencia. En el Capítulo 2, hemos anotado las CAZymes codificadas en el genoma de P. chlamydosporia. Este hongo contiene en su genoma una maquinaria degradadora de polisacáridos de pared celular vegetal. P. chlamydosporia es capaz de degrader celulosa, xilano y, en menor medida, pectina. Estas enzimas pueden proporcionar información sobre preferencias del huésped por parte del hongo (De Vries y Visser, 2001; King et al., 2011). En futuros estudios se podría analizar la función de estas enzimas, que podrían estar relacionadas con la infección de hembras de nematodos debido a que se encuentran embebidas en los tejidos vegetales de las raíces (Lopez-Llorca y Duncan, 1991). El elevado número de quitosanasas identificado en el genoma de P. chlamydosporia puede explicar su gran capacidad en la degradación de quitosano (Palma-Guerrero et al., 2008). En estudios recientes se ha abordado la producción de quitosanasas recombinantes (Huang et al., 2016). El estudio de la actividad de las quitosanasas de P. chlamydosporia es muy interesante debido a su posible aplicación biotecnológica. Sin embargo, tratando de explicar el motivo por el que P. chlamydosporia posee un número tan elevado de quitosanasas y el rol del quitosano en el estilo de vida nematófago del hongo, hemos inmunolocalizado quitosano en huevos de M. javanica parasitados por este hongo. El quitosano se ha detectado, especialmente, en los apresorios formados por el hongo. La cubierta de los huevos de nematodo está formada, básicamente, por proteína y quitina (Bird y Bird, 1991). Sin embargo, no parece haber resultados que indiquen la presencia de quitosano en los huevos de nematodo. Esto podría indicar que P. chlamydosporia produce quitosano durante el parasitismo de huevos de M. javanica. En esta Tesis Doctoral, se puede concluir que las enzimas modificadoras de quitina y quitosano de P. chlamydosporia son posibles factores de virulencia del hongo en la infección de huevos de nematodo. Es necesario llevar a cabo aproximaciones de carácter bioinformático, genético, proteómico y metabolómico para aumentar el conocimiento sobre los determinantes de patogenicidad de P. chlamydosporia y mejorar el hongo como agente de control biológico. Las quitosanasas de este hongo degradan eficientemente quitosano y los azúcares reductores producidos por este hongo pueden ser fermentados a etanol. Futuros ensayos dirigidos a mejorar la transformación de quitosano/quitina a etanol por parte de P. chlamydosporia darán lugar a una nueva generación de biocombustibles sostenibles y viables económicamente. Con todo ello, las conclusiones que se derivan de esta Tesis Doctoral son las siguientes: 1. La regeneración de la pared celular aumenta la resistencia de los hongos a quitosano. 2. El quitosano y la caspofungina (un inhibidor de la β-1,3-glucano sintasa) actúan sinérgicamente reduciendo el crecimiento de Neurospora crassa. 3. El quitosano inhibe la expresión de genes implicados en la síntesis de glucanos de la pared celular de Neurospora crassa. 4. El contenido de β-1,3-glucanos del hongo resistente a quitosano, Pochonia chlamydosporia es mayor que el de Neurospora crassa, sensible a este polímero. 5. El contenido de CAZymes (enzimas activas sobre carbohidratos) basado en una maquinaria degradativa de la pared celular vegetal y en un sistema de degradacioón de quitina/quitosano explica el estilo de vida multitrófico de Pochonia chlamydosporia. 6. Pochonia chlamydosporia produce quitosano durante el proceso de infección de huevos de nematodos agalladores. 7. Pochonia chlamydosporia induce la expresión génica de quitosanasas y quitín desacetilasas durante la infección de huevos de nematodos agalladores, lo que sugiere su papel en la virulencia del hongo. 8. Pc_2566, una quitín desacetilasa predicha de Pochonia chlamydosporia, contiene un péptido señal y dos motivos de unión a quitina (CBM18) flanqueando el dominio catalíco, similar al de Colletotrichum lindemuthianum. 9. El dominio catalítico Pc_2566 tiene actividad deacetilasa sobre los oligomeros de quitina DP4 y DP5. 10. Pochonia chlamydosporia, Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana pueden usar quitosano como único nutriente, incluso en condiciones anaeróbicas. 11. Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana pero especialmente Pochonia chlamydosporia generan azúcares reductores a partir de quitosano y los fermentan a etanol.