Análisis morfológico y funcional de la interacción Podosphaera xanthii-cucurbitáceas

Resumen

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren las células vivas de su hospedador. Estos patógenos desarrollan una estructura especializada responsable de la absorción de nutrientes y la secreción de efectores en la planta denominada 'haustorio‘. Los efectores son pequeñas proteínas secretadas responsables de interactuar con la respuesta de defensa de la planta. Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas en el sur de España, presenta 138 efectores candidatos (CSEPs). En este trabajo hemos llevado a cabo el aislamiento y análisis morfológico del haustorio de P. xanthii, primero en el interior de las células epidérmicas de melón con el fin de determinar su estructura y facilitar su aislamiento. Posteriormente, para estudiar en detalle la morfología de los haustorios de P. xanthii se llevó a cabo la puesta a punto de un método de aislamiento selectivo de haustorios a partir de cotiledones de calabacín completamente infectados. Mediante técnicas de microscopía confocal (CLSM) observamos diferentes estructuras del haustorio como el cuerpo, lóbulos, cuello y septum, no así EHM y EHMx. En paralelo, se realizó una tinción vital de haustorios de P. xanthii con un colorante específico de membranas, observándose un patrón diferente en la distribución de pequeñas vesículas, endosomas y MVB, entre lóbulos y cuerpo del haustorio, sugiriendo que los lóbulos serían los máximos responsables del tráfico de vesículas y, probablemente, los principales mediadores del diálogo molecular con la planta. Además, hemos puesto a punto la metodología necesaria para la transformación de P. xanthii empleando la bacteria Agrobacterium tumefaciens. De esta forma, hemos desarrollado dos vías distintas para la transformación de P. xanthii; i) transformando directamente conidias y ii) la transformación indirecta a través del haustorio. Mediante ambas metodologías hemos obtenido colonias resistentes a una concentración determinada de higromicina y carbendazima. Además, estas colonias expresaban la proteína GFP bajo el control de un promotor constitutivo. Los análisis moleculares determinaron la integración del material genético en el genoma de P. xanthii. En lo referente a la estabilidad observamos que la transformación directa de conidias el DNA introducido se mantenía durante sucesivas generaciones sólo en presencia del agente de selección. En el caso de la transformación indirecta no obtuvimos colonias transformadas más allá de la primera generación. Para el estudio funcional de efectores llevamos a cabo dos rutas; i) silenciamiento de los efectores en cotiledones de melón mediante A. tumefacines y ii) análisis informáticos. Mediante el uso conjunto de estas metodologías hemos identificado una nueva familia de quitinasas secretadas en la papila de la planta. Estas quitinasas están ampliamente distribuidas y conservadas entre multitud de hongos todos ellos patógenos. Los análisis de la actividad muestran su participación en la interacción con la planta, degradando la quitina liberada de la pared celular del hongo. Además, el análisis de dos quitinas deacetilasas ha mostrado que son vitales para el desarrollo de la infección, siendo buenas dianas para el desarrollo de nuevos fitosanitarios. Finalmente, derivado del gen de quitina deacetilasa hemos identificado un nuevo efector con afinidad por la quitina.