Análisis de la expresión de clusterina en líneas celulares de adenocarcinoma de colon. Cambios en el perfil proteico durante la diferenciación de la línea caco-2

Zusammenfassung

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más frecuentes en el mundo occidental. En Europa, es el tercer cáncer en incidencia en hombres y el segundo en mujeres, y se estima que en España, durante el año 2010, se detectaron aproximadamente 25.000 nuevos casos. En cuanto a la mortalidad que ocasiona, es la segunda neoplasia más importante, tras el cáncer de pulmón en hombres y el de mama en mujeres, ya que la mayoría de los casos se detectan cuando la enfermedad se encuentra en estadios avanzados. El CCR reúne las condiciones para ser considerado susceptible de prevención, ya que constituye un problema de salud importante, se conoce su historia natural y el tratamiento es más efectivo cuando se diagnostica en un estadio temprano. Los marcadores séricos empleados actualmente en la práctica clínica para el CCR, como el antígeno carcinoembrionario (CEA) o los antígenos CA 19-9 y CA 72-4 son controvertidos en lo que respecta a su utilidad para el diagnóstico, y se consideran más bien herramientas complementarias para la selección de la terapia más adecuada. Por todo ello, sigue siendo necesario, y representa un reto de la investigación biomédica, encontrar nuevos marcadores séricos para el diagnóstico del CCR que sean específicos y presenten una elevada sensibilidad. Una proteína propuesta como candidata a biomarcador para el CCR es la clusterina (CLU), aunque los datos existentes en la bibliografía son contradictorios, pues se ha descrito tanto un incremento como un descenso de su expresión en los tumores. Esta proteína, que se expresa en las células epiteliales de numerosos órganos, y aparece secretada en diversos fluidos corporales, interviene en varios procesos implicados en la formación y la progresión tumoral como la adhesión celular, la diferenciación y remodelación tisular, la regulación del ciclo celular y del sistema inmune, la reparación del ADN y la apoptosis. Se trata de una proteína multifuncional que se caracteriza por presentar diversas formas proteicas con diferente localización subcelular y distinta función biológica. La aparente disparidad de resultados sobre la expresión de CLU en tumores colorrectales podría deberse, por un lado, a la heterogeneidad celular de los tumores y, por otro, a que se desconoce qué formas de esta proteína se expresan en cada momento, por lo que la alteración de CLU en los tumores podría estar ocasionada por un cambio en su patrón de isoformas. Por ello, en esta Tesis nos planteamos profundizar en el conocimiento de la relación entre la CLU y el CCR, analizando la expresión de sus distintas isoformas durante la progresión tumoral y la metástasis. Para poder estudiar las isoformas de CLU expresadas específicamente por las células epiteliales de la mucosa colónica, analizamos su expresión en líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano; en concreto, en células Caco-2, SW-480 y SW-620. La línea celular Caco-2 es útil para estudiar cambios asociados a la progresión tumoral, ya que estas células son capaces de diferenciarse espontáneamente ¿in vitro¿, y se considera que dicho proceso representa la evolución de las células tumorales desde un fenotipo maligno a un fenotipo similar al normal, de modo opuesto a lo que ocurre durante la transformación maligna. Por su parte, las líneas celulares SW-480 y SW-620, obtenidas a partir del mismo paciente en momentos distintos de la enfermedad, y que presentan distinta capacidad invasiva y de producir metástasis, constituyen un modelo que permite estudiar los cambios de expresión de proteínas durante la progresión metastásica en CCR. Otro objetivo de este trabajo era identificar otras proteínas secretadas por las células tumorales que experimenten cambios en su expresión durante la transformación tumoral, y que puedan ser candidatas a biomarcadores para el CCR. Considerando las limitaciones que presenta la búsqueda de marcadores tumorales en suero, donde unas pocas proteínas mayoritarias enmascaran otras menos abundantes y que podrían ser de utilidad, se han descrito otras alternativas como el análisis proteómico de los fluidos proximales tanto a los tumores como a líneas celulares tumorales. Las proteínas liberadas in vitro por las células tumorales pueden asimilarse, hasta cierto punto, a las proteínas liberadas in vivo por el tumor; por ello, el análisis del secretoma de células en cultivo puede ser una forma de encontrar posibles marcadores séricos. En nuestro caso optamos por analizar los cambios en el perfil proteico del secretoma de las células Caco-2 comparando los estados no diferenciado y diferenciado. El análisis de la expresión de CLU durante la diferenciación de la línea celular Caco-2 mostró una sobreexpresión del precursor de la forma secretada (sCLU) y de la cantidad total de CLU en las células no diferenciadas, así como un incremento de la forma madura de sCLU en el secretoma de estas células, lo que sugiere un aumento de la síntesis y secreción de esta proteína en las células Caco-2 que presentan un fenotipo tumoral. Las isoformas de sCLU presentes en los extractos celulares y en el secretoma de las células Caco-2 diferenciadas mostraban valores de pI más básicos que las detectadas en el caso de las células no diferenciadas, lo que podría deberse a cambios en la glicosilación de esta proteína durante la diferenciación celular. Para determinar la posible relación de la CLU con los procesos de invasión y metástasis se analizó su expresión en las líneas celulares SW-480 y SW-620. Observamos una mayor expresión de la forma madura de sCLU en el secretoma de las células SW-480. La sobreexpresión de sCLU observada tanto en las células SW-480 como en las células Caco-2 no diferenciadas, ambas obtenidas a partir de tumores en estadio B, sugiere un posible papel de esta forma de CLU en la eliminación de los restos celulares derivados de la destrucción producida por la invasión tumoral. Por el contrario, las células SW-620, procedentes del nódulo metastásico, habrían perdido la sobreexpresión de sCLU y de su precursor. En conjunto, nuestros resultados indican que durante la transformación maligna de las células epiteliales de colon se produce un incremento en la expresión de sCLU, y que dicha sobreexpresión parece estar relacionada con la invasión tumoral. El análisis mediante electroforesis diferencial en gel (DIGE) de la composición proteica del secretoma de células Caco-2 no diferenciadas y diferenciadas permitió localizar 66 spots cuya expresión variaba significativamente durante la diferenciación celular. Entre estos se lograron identificar un total de 30 spots, correspondientes a 20 proteínas diferentes; de ellas 11 presentaban mayor expresión en las células no diferenciadas y 9 se expresaban mayoritariamente en las células diferenciadas Las proteínas identificadas cumplen diversas funciones biológicas. Encontramos enzimas que participan en el procesamiento de las N-glicoproteínas (glucosidasa II), en el metabolismo glucídico (enolasa I, triosa fosfato isomerasa, isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP), en la obtención de ATP (ATP sintasa, creatina quinasa B) o en la detoxificación (carboxilesterasa hepática), así como chaperonas (HSP90B1), proteínas implicadas en la regulación de la división celular (TCTP) o de la adhesión (proteína TGFßI), en el transporte (apolipoproteínas A-I, A-IV y E, transtiretina), o que son componentes del citoesqueleto (tubulina beta, actinina alfa-4). Entre las proteínas identificadas aparecían varias que resultaban interesantes como potenciales marcadores para el CCR, bien porque no habían sido estudiadas hasta el momento en relación con esta patología, como las proteínas NPC2 o catepsina A, o bien porque habían sido relacionadas previamente, pero existían datos contradictorios, como es el caso de las proteínas TCTP, TGFßI, HSP90B1 o NDK A. De todas ellas, decidimos analizar con más detalle la expresión de la proteína NDK A, y utilizarla para validar los resultados obtenidos mediante DIGE. Elegimos esta proteína porque en nuestro laboratorio se había observado previamente que presentaba mayor expresión en los tumores que en la mucosa sana; y por otro lado, porque aunque se ha descrito su presencia en el suero de pacientes con distinto tipo de cáncer, no existen referencias sobre su expresión sérica en pacientes con CCR. La proteína NDK A se había identificado a partir de un spot que presentaba mayor expresión en el secretoma de las células Caco-2 no diferenciadas, y su inmunodetección, mediante Western blot, confirmó los resultados obtenidos mediante DIGE. Al analizar la expresión de esta proteína en el secretoma de las líneas celulares con diferente potencial metastásico SW-480 y SW-620, observamos que era mayor en las células menos invasivas. La mayor expresión de NDK A en las células SW-480, y en las células Caco-2 no diferenciadas, ambas obtenidas a partir de tumores de estadio B, sugiere una sobreexpresión de esta proteína en los primeros estadios de la carcinogénesis, lo que indica que podría ser un buen marcador tumoral para el CCR si pudiera detectarse en suero. Tras eliminar, mediante cromatografía de afinidad, las proteínas séricas más abundantes, conseguimos detectar la presencia de NDK A en muestras de suero de pacientes y donantes sanos. La banda correspondiente a la proteína era muy tenue en todas las muestras, por lo que fue imposible llevar a cabo su cuantificación; sin embargo, se observaba que su expresión era mayor en el suero de los pacientes. Este resultado es prometedor ya que sugiere el posible valor de esta proteína como marcador sérico para el CCR, si bien para su validación será necesario recurrir a métodos cuantitativos más sensibles como el ELISA, y determinar sus niveles en el suero de una amplia cohorte de pacientes e individuos sanos.