Identificación de potenciales biomarcadores para el cáncer colorrectal mediante técnicas proteómicas

Resumen

El cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias más frecuentes en Europa, situándose en el segundo puesto tanto en incidencia como en mortalidad. Por ello, resulta crucial la búsqueda de nuevos marcadores tumorales que, además de contribuir a mejorar tanto el diagnóstico como el pronóstico de esta enfermedad, permitan realizar un seguimiento adecuado de la patología. Además, es necesario encontrar terapias alternativas a las empleadas actualmente para tratar el CCR de forma más adecuada. En el ámbito de la investigación biomédica una de las áreas más prometedoras para abordar esta búsqueda es la proteómica, por lo que en esta Tesis Doctoral se han empleado técnicas proteómicas para detectar proteínas con utilidad clínica para el CCR. Se ha llevado a cabo un estudio proteómico de expresión diferencial con el objetivo de identificar y cuantificar proteínas con un nivel de expresión alterado como consecuencia del estado patológico. En primer lugar se empleó una estrategia habitual en proteómica, que consiste en el uso de un método de prefraccionamiento de la muestra previo a la separación electroforética. Esta estrategia permite enriquecer la muestra en un grupo de proteínas de interés, o simplemente la divide en varias fracciones en función de una determinada característica proteica. Así se mejora la resolución de los mapas y se consigue detectar mayor número de proteínas, incluyendo las denominadas proteínas de baja abundancia que tienen especial importancia en el descubrimiento de nuevos marcadores tumorales y dianas terapéuticas. A continuación, se realizaron y compararon mapas bidimensionales de proteínas de mucosa sana y tumoral de pacientes con CCR. Por último, se emplearon criterios estadísticos y biológicos para seleccionar entre las proteínas con expresión alterada aquellas con potencial valor en clínica, realizando un estudio proteómico más detallado de las mismas. El protocolo de fraccionamiento de la muestra que hemos empleado en este trabajo se basa en el uso del detergente Triton X-114, obteniéndose dos fracciones proteicas: una fracción enriquecida en proteínas asociadas a membrana y otra enriquecida en proteínas solubles. La inmunodetección de una proteína específica de membrana (caveolina-1) permitió comprobar que el fraccionamiento había sido eficaz. Por otro lado, comprobamos que todas las proteínas identificadas en la fracción soluble habían sido descritas previamente como proteínas solubles que se localizan en distintos compartimentos celulares, como el citosol o el núcleo, mientras que la mayoría de las proteínas identificadas en la fracción de membrana habían sido descritas como proteínas integrales de membrana o como proteínas asociadas a membrana. Una vez realizado el análisis de los mapas proteicos y la identificación de las proteínas cuya expresión variaba en los tumores hemos comprobado que, por un lado, el proceso tumoral afecta a proteínas, tanto solubles como de membrana, implicadas en la transducción de señales, la apoptosis, la proliferación celular, la angiogénesis y la metástasis. Por ello, estas proteínas pueden ser consideradas potenciales marcadores tumorales para el cáncer colorrectal. Por otro lado, hemos corroborado que la metodología empleada en este trabajo es adecuada como herramienta para abordar la búsqueda de biomarcadores, ya que algunas de las proteínas cuya expresión se encontró alterada en los tumores colorrectales habían sido propuestas previamente como candidatas a marcadores tumorales para esta patología. Es el caso de la mortalina, de las proteínas antioxidantes superóxido dismutasa 1 (SOD1) y glutatión S-transferasa P1-1 (GSTP1-1), del factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF) y de las proteínas de unión al calcio S100A6 y S100A11. Aún más interesante ha sido encontrar proteínas con un nivel de expresión alterado en tumores, que no se habían relacionado previamente con el CCR, como la 3-hidroxi-isobutirato deshidrogenasa, la piridoxal quinasa, la chaperona A específica de tubulina o la proteína de unión a retinoblastoma 4, entre otras. En la fracción soluble se detectaron 91 proteínas alteradas, de las cuales 49 presentaban un incremento de expresión en los tumores y 42 un descenso. Debido al elevado número de proteínas cuyos niveles variaban, únicamente se analizaron mediante espectrometría de masas un conjunto de 18 proteínas seleccionadas mediante estadística multivariante (17 con un incremento de expresión en los tumores y solamente una con descenso). Se identificó prácticamente el 90% de ellas, encontrándose proteínas con actividad enzimática (PD-ECGF/fosforilasa de timidina, piridoxal quinasa, nucleósido difosfato quinasa A/factor inhibidor de metástasis nm23-H1, enolasa 1, entre otras), proteínas antioxidantes (peroxiredoxinas 2 y 3, proteína DJ-1), proteínas implicadas en rutas de señalización celular (14-3-3 zeta), proteínas del metabolismo de la cromatina (proteína de unión a retinoblastoma 4) y del plegamiento de la tubulina (chaperona A específica de tubulina), y proteínas de unión a calcio (calgizarina o S100A11). La proteína de unión a retinoblastoma 4, la proteína DJ-1, la proteína 14-3-3 zeta y la nucleósido difosfato quinasa A fueron seleccionadas, en función de los resultados obtenidos mediante estadística multivariante y de su implicación documentada en el cáncer, como las mejores candidatas para comprobar su alteración y comenzar un estudio dirigido a evaluar su utilidad como biomarcadores para el CCR. La proteína de unión a retinoblastoma 4 participa en el metabolismo de la cromatina, mientras que DJ-1 es una proteína con actividad antioxidante y oncogénica. La proteína 14-3-3 zeta modula la interacción entre distintos intermediarios de señalización intracelular y presenta un importante papel oncogénico, y la nucleósido difosfato quinasa A está relacionada con la metástasis. En todos los casos, utilizando técnicas de inmunodetección, se corroboró la alteración en los niveles de expresión observada en el estudio de electroforesis bidimensional, comprobándose además que, en la mayoría de los casos, la variación observada mediante ambas técnicas era muy similar. En la fracción de membrana se detectaron 41 proteínas alteradas en relación con la patología, 30 con un descenso en su expresión en los tumores y 11 con un incremento, de las cuales se identificaron el 56% mediante espectrometría de masas. Estas proteínas se agruparon en proteínas del citoesqueleto (vimentina, citoqueratinas 10 y 18/19, desmina, alfa-actina y beta-actina), chaperonas (proteína de 78 kDa regulada por glucosa, proteína de estrés de 70 kDa o mortalina, prohibitina, proteína de choque térmico de 27 kDa), proteínas de unión a calcio (calciclina o S100A6), proteínas antioxidantes (superóxido dismutasa [Cu-Zn], glutatión S-transferasa P1-1), proteínas de generación de energía (cadena beta de la ATP sintasa mitocondrial) y proteínas de transporte (cadena beta de la hemoglobina, proteína intestinal de unión a ácidos grasos, apolipoproteína A-I), entre otras. Empleando pruebas estadísticas multivariantes fue posible seleccionar dos proteínas (prohibitina y vimentina), cuyo patrón de expresión permitía diferenciar el estado patológico del sano, constituyendo un panel de potenciales biomarcadores. La vimentina es una proteína del citoesqueleto que ha sido recientemente relacionada con la señalización, la adhesión y la migración celular, mientras que a la prohibitina se le han adjudicado funciones relacionadas con el crecimiento celular, el envejecimiento y la carcinogénesis. Por ello, se procedió a comprobar la alteración de estas proteínas mediante Western blot en una y dos dimensiones. La vimentina presentó un descenso de expresión en los mapas bidimensionales de los tumores y, mediante Western blot, se detectaron diversas isoformas de masa molecular (Mr) y punto isoelétrico (pI), todas ellas con una expresión disminuída o ausente en los tumores. Con la misma metodología se confirmó el incremento de expresión de la prohibitina detectado en los mapas bidimensionales de los tumores, observándose igualmente distintas isoformas de Mr y pI. Por último, hemos comprobado que algunas de las proteínas seleccionadas pueden detectarse en el suero de pacientes con CCR. Es el caso de las proteínas DJ-1, nucleósido difosfato quinasa A y prohibitina, observándose una relación entre sus niveles séricos y la metástasis a distancia que podría ser útil en clínica para el seguimiento del CCR. A modo de conclusión, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han demostrado la utilidad y efectividad de la metodología empleada para llevar a cabo un estudio proteómico dirigido a la búsqueda de nuevos marcadores tumorales y dianas terapéuticas para el CCR. Entre las proteínas cuya expresión se encontró alterada consideramos que, por su marcado incremento de expresión en los tumores, por su relevancia en el análisis estadístico multivariante y por la relación de sus niveles séricos con la metástasis tumoral, la nucleósido difosfato quinasa A es la mejor candidata para ser evaluada como marcador tumoral para esta patología.