Estudio de moléculas de adhesión y migración en cáncer de colon

Resumen

JUSTIFICACIÓN: El cáncer colorrectal es el tercer tumor en incidencia a nivel mundial y el de mayor incidencia en España, teniendo en cuenta ambos sexos. Además, en los últimos años su incidencia está en aumento, posiblemente en relación con factores ambientales y el envejecimiento de la población. En las últimas décadas, se han realizado grandes avances en esta patología, tanto en la comprensión de sus bases moleculares como en el diseño de nuevas estrategias terapéuticas. A pesar de ello, supone la segunda causa de muerte por cáncer en nuestro país. Por todo esto, el CCR supone un problema de gran magnitud en nuestro medio. Varios estudios científicos sugieren que el origen de muchos tipos de cáncer reside en una población poco común de células que son las exclusivamente responsables de conservar la capacidad de auto-renovación y mantenimiento del tumor (es decir, “células stem cancerígenas” –CSC-) En este contexto, una pequeña población de células cancerígenas adquiriría propiedades características de células stem. En algunos casos, las células stem tumorales podrían derivar directamente de las células stem normales de un tejido. En cualquiera de las situaciones el resultado final sería el mismo, y se ha planteado que serían estas CSC las que deberían emplearse como diana para el tratamiento del cáncer. El desafío para esta aproximación es encontrar marcadores de las CSC. SLUG (también llamado SNAIL-2) es un gen que interviene en el proceso de transición epitelio-mesénquima y está implicado en el desarrollo tumoral a través de la adquisición de propiedades migratorias, invasivas y de supervivencia de las células epiteliales. También se ha mostrado que su activación podría formar parte de las alteraciones moleculares que caracterizarían a las CSC. Por otra parte, estudios clínicos en pacientes con cáncer de mama llevados a cabo por nuestro grupo confirman la posibilidad de detectar células circulantes que expresan SLUG. En este trabajo se pretende analizar la detección del gen SLUG en sangre periférica y su valor como factor pronóstico en pacientes con cáncer de colon. SLUG se expresa en carcinomas de colon humanos por lo que, además de poder ser utilizado para diagnóstico precoz del mismo, pudiera ser una diana terapéutica específica para combatir la diseminación tumoral. E-cadherina es una glicoproteína transmembrana implicada en transducción de señales, apoptosis y supresión de la invasión y metástasis. La inactivación de la adhesión mediada por ella se asocia con la progresión tumoral. Entre otras funciones, SLUG es uno de los factores reguladores de E-cadherina, por lo que también se analizará la relación de la expresión de ambos. Este trabajo pretende estudiar la expresión de estas proteínas en distintas fases de la enfermedad. OBJETIVOS: OBJETIVOS GENERALES: 1. Determinar el valor pronóstico de la expresión de SLUG en cáncer colorrectal localizado y metastásico. 2. Estudiar la relación de SLUG con E-cadherina y su valor conjunto como factor pronóstico. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Determinación de la expresión del gen SLUG en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal. 2. Analizar la expresión de E-cadherina en el tejido tumoral de dichos pacientes. 3. Estudiar la relación de la expresión de SLUG en pacientes con cáncer colorrectal localizado con otras variables clínico-patológicas de importancia pronóstica reconocida. 4. Examinar la asociación de la expresión de E-cadherina de pacientes con cáncer colorrectal localizado con otras variables clínico-patológicas de importancia pronóstica reconocida. 5. Analizar la relación entre la expresión de SLUG en sangre periférica y de E-cadherina en tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal localizado. 6. Determinar la influencia de la expresión de SLUG en sangre periférica y de E-cadherina en tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal localizado sobre su supervivencia (libre de enfermedad y global) 7. Estudiar la asociación de la detección de SLUG en sangre periférica con otras variables pronósticas en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. 8. Analizar la influencia de la expresión de SLUG en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal metastásico sobre su supervivencia (libre de progresión y global) MATERIAL Y MÉTODOS: SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DE MUESTRAS: Selección de pacientes con cáncer de colon, atendidos en el Servicio de Oncología Médica del Hospital Universitario de Salamanca en el periodo de 4 años. Filiación completa de su enfermedad (edad, tamaño del tumor, diagnóstico anatomopatológico, afectación ganglionar, presencia de metástasis a distancia). Seguimiento del tratamiento administrado, recogiendo el periodo libre de enfermedad y la supervivencia. A estos pacientes, previo consentimiento informado, se les realiza la extracción de 6 mL de sangre periférica. Estas muestras son identificadas y relacionadas con las respectivas historias clínicas. En la Unidad de Medicina Molecular del Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer se realiza la detección de CSC mediante estudio de la expresión del gen SLUG en sangre periférica. La muestra histológica es recogida por el Servicio de Anatomía Patológica, para los posteriores estudios de expresión de E-cadherina en tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal. Los resultados obtenidos y los datos de cada paciente se almacenan en una base de datos duplicada creada a tal efecto con los softwares informáticos “Filemaker pro” y “Excel”. TÉCNICAS DE DETECCIÓN: En la Unidad de Medicina Molecular del Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca se realiza la obtención y almacenamiento de mRNA, cDNA y DNA genómico de las diferentes muestras de sangre periférica y el análisis molecular de las mismas. Las muestras de mRNA se obtienen en un plazo máximo no superior a 5 horas desde su extracción. Todas las muestras permanecen almacenadas a -70ºC en criotubos eppendorf libres de RNAasa. Se utilizan 10 µL de cDNA de cada muestra para la detección de SLUG por técnica de RT-PCR, y otros 10 µL como control interno para la detección de actina. En el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario de Salamanca se realiza la detección de E-Cadherina en las muestras de tejido tumoral previamente conservadas en formol, mediante técnicas de inmunohistoquímica. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Se realiza un estudio estadístico descriptivo de las diferentes variables cuantitativas y cualitativas con significación pronóstica en los pacientes con cáncer de colon locorregional y metastático, y después, mediante estadística comparativa, se hace un estudio de correlación con la expresión de SLUG en sangre periférica y con la expresión de E-cadherina. Además, se lleva a cabo el análisis de supervivencia de los pacientes con cáncer de colon metastático (supervivencia libre de progresión y supervivencia global) También se analiza la influencia de las distintas variables sobre los resultados de supervivencia. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Estudiamos un total de 168 casos de cáncer colorrectal, de los que 95 tenían enfermedad localizada y 73 enfermedad avanzada en el momento de entrada en el estudio. Tras valorar las muestras disponibles de cada paciente, para homogeneizar la muestra y poder extraer conclusiones, se procedió de la siguiente manera: Para el análisis estadístico seleccionamos los 80 pacientes con CCR localizado en los que se obtuvo la muestra al iniciar la adyuvancia o en los que se programó seguimiento (por no tener indicación de tratamiento adyuvante) y los 68 pacientes con CCR metastásico en los que la extracción de la muestra se realizó en un momento en el que la enfermedad estaba en progresión. En cuanto al estudio de E-cadherina, éste fue posible realizarlo en 86 pacientes en total, el resto no tenían muestra histológica válida. El análisis de los resultados de este estudio, nos permite, a nuestro juicio, formular las siguientes conclusiones: 1. La detección de SLUG en sangre periférica es más frecuente en los pacientes con cáncer colorrectal metastásico ( 65%) que en aquellos con cáncer colorrectal localizado (31%). 2. En nuestro estudio, existe relación entre la expresión de SLUG y la extensión metastásica de la enfermedad (OR 4,03; p,000). 3. En nuestra serie, la detección de SLUG no se relaciona con otras variables de interés pronóstico analizadas en los pacientes con cáncer colorrectal localizado. 4. En las muestras de cáncer colorrectal localizado incluidas en este trabajo, la expresión de E-cadherina se relaciona con el grado histológico, asociándose a tumores de bajo grado (p,039). 5. En el presente estudio, no hemos observado relación entre la detección de SLUG en sangre periférica y la expresión de E-cadherina en tejido tumoral de los pacientes con cáncer colorrectal estadio I-III. 6. La detección de SLUG es un factor que podría determinar una peor supervivencia libre de enfermedad en los pacientes con cáncer colorrectal localizado de nuestra serie (En el análisis con los 80 pacientes seleccionados HR 2,08; p,070. En análisis exploratorio incluyendo los 95 pacientes con CCR localizado HR 2,06; p,045) 7. En nuestro trabajo, la detección de SLUG determina una peor supervivencia global en los pacientes con cáncer colorrectal localizado (HR 2,30; p,013). 8. En la presente serie, no hemos observado influencia de la expresión de E-cadherina sobre la supervivencia libre de enfermedad ni sobre la supervivencia global de los pacientes con cáncer colorrectal localizado. 9. Al analizar la influencia conjunta de ambas variables, SLUG y E-cadherina, sobre la supervivencia, no hemos obtenido resultados estadísticamente significativos. 10. En nuestro análisis, la detección de SLUG se relaciona con otras variables pronósticas en cáncer colorrectal metastásico: el número de localizaciones metastásicas (OR 3,46; p,048), la presencia de metástasis hepáticas (OR 4,44; p,006) y el número de líneas de tratamiento (OR 8,40; p,002). 11. La detección de SLUG determina una peor supervivencia libre de progresión en los pacientes con cáncer colorrectal avanzado incluidos en el presente trabajo (HR 1,94: p,012). 12. En nuestros resultados no hemos observado influencia de la detección de SLUG en sangre periférica en la supervivencia global de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico.