Novel contributions of cohesin and PDS5 to maintain genome stability during dna replication

Resumen

El complejo de cohesina juega un papel esencial en la organización cromosómica y afecta así a la mayor parte de los procesos nucleares. La asociación de la cohesina con la cromatina es dinámica, una característica que regula sus funciones y que viene determinada por la acción de varias proteínas que se asocian al complejo. PDS5 es una de ellas. En células de vertebrados, existen dos isoformas de PDS5, PDS5A y PDS5B, cuyas funciones específicas aún se desconocen. Para aclarar esta cuestión, hemos tratado de identificar proteínas que interaccionaran de forma exclusiva con PDS5A y PDS5B analizando los inmunoprecipitados obtenidos de extractos de células humanas con anticuerpos que reconocen una u otra isoforma mediante espectrometría de masas. Si bien nuestra aproximación experimental no ha tenido éxito, en el camino hemos encontrado que ambas isoformas de PDS5 interaccionan con proteínas que participan en la protección de horquillas de replicación. Por ello, decidimos profundizar en resultados previos de nuestro grupo que apuntaban a la importancia de la asociación dinámica de la cohesina con cromatina en el proceso de replicación del ADN. Con este fin se generaron líneas celulares humanas deficientes para una o ambas proteínas PDS5. Mediante ensayos de molécula única en fibras de ADN confirmamos que la eliminación de las proteínas PDS5, o de otro factor denominado WAPL que también descarga la cohesina de la cromatina, impide el avance eficiente de la horquilla de replicación. Estos defectos se rescatan al eliminar la cohesina. También demostramos que PDS5 y cohesina son necesarias para proteger la integridad de las horquillas de replicación que están paradas, pues facilitan el reclutamiento a dichas horquillas de BRCA2, RAD51 y WRNIP1. Estas proteínas, a su vez, impiden la acción de la nucleasa MRE11. Tanto PDS5A como PDS5B, pueden descargar la cohesina de cromatina y reclutar a las proteínas que participan en la protección de las horquillas replicativas, de modo que sólo se observan defectos en estos procesos en ausencia de ambas isoformas. En esta condición, las células apenas proliferan y se observa acumulación de daño en el ADN y mayor muerte celular. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto la importancia de cohesina y las proteínas PDS5 en la replicación del ADN y en la protección de las horquillas de replicación que tiene lugar en respuesta al estrés replicativo.