Clonación y caracterización de una hidrofobina de clase II (CaHPB) de Candida albicans

Resumen

Las hidrofobinas son una familia de proteínas fúngicas hidrofóbicas de secreción, de pequeño tamaño molecular, que exhiben capacidad para autoensamblarse y para unirse a una interfase hidrofílica/hidrofóbica formando una película anfipática (Wessels, 1997). Son proteínas que se dan exclusivamente en hongos miceliares, se caracterizan por presentar ocho residuos de cisteína conservados en sus secuencias (Wessels, 1994, 1997) que forman puentes disulfuro intramoleculares (De Vries et al., 1993), y están implicadas en la formación de estructuras aéreas y en la unión de las hifas a estructuras hidrofóbicas formando agregados. Estas proteínas poseen gran importancia en los pasos iniciales de la patogénesis fúngica y también son fuentes potenciales para su uso en aplicaciones biomédicas (Wessels, 1997). En este trabajo se describe por primera vez en el hongo dimórfico, patógeno oportunista, Candida albicans, la caracterización de una especie perteneciente a esta familia de proteínas. Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión con un anticuerpo policlonal específico de la forma micelial de C. albicans (mPAb), se ha aislado, clonado y caracterizado un nuevo gen de este hongo, al que se ha denominado CaHPB. Dicho gen contiene un posible marco abierto de lectura que codifica para una proteína de 250 aminoácidos (CaHpbp) con un peso molecular de 25.173 Da. El análisis informático de la secuencia reveló la existencia de una región de unos 115 aminoácidos que contiene ocho restos de cisteína localizados en posiciones altamente conservadas, así como de un péptido señal de secreción y de un posible motivo tipo GPI, características compartidas con otras proteínas de la pared celular de C. albicans parcialmente caracterizadas como son Rbt5p y Csa1p/Wap1p. Los ensayos de inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal monoespecífico generado frente a un dominio inmunogénico de la proteína CaHpbp (PAb anti-CaHpbp) reveló que esta molécula se encontraba presente en la superficie celular de C. albicans, mayoritariamente en la forma micelial del hongo. El análisis mediante inmunotransferencia de diferentes extractos obtenidos tanto de paredes celulares aisladas como de células intactas, utilizando el PAb anti-CaHpbp como sonda, indicó que la proteína CaHpbp es secretada al medio extracelular, encontrándose asociada a la superficie de las células del hongo mediante interacciones de tipo no covalente. El marcaje con cisteína radiactiva permitió cuantificar la eficacia de diferentes agentes para solubilizar la especie CaHpbp, encontrándose que el SDS al 1% a pH 9 y el etanol al 60% eran los tratamientos que tenían mayor capacidad de extracción. La especie CaHpbp mostró capacidad para interaccionar con micelas de aceite en una interfase hidrofílica/hidrofóbica de agua y aceite, formando en la superficie de las mismas una capa detectable mediante inmunofluorescencia con el PAb anti-CaHpbp, que podría representar una membrana anfipática. La molécula CaHpbp presente en el medio de cultivo también exhibió la propiedad de adsorberse a la superficie de microesferas de vidrio. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la especie CaHpbp se trata de una hidrofobina de clase II, moléculas de secreción que hasta el momento no se han identificado en C. albicans, aunque sí en otras especies de hongos patógenos. CaHpbp se expresa in vivo, como se deduce de los resultados de la detección inmunohistoquímica en los cuales, se observa la expresión de esta molécula en células de C. albicans presentes en muestras de tejidos obtenidas por necropsia y biopsia de pacientes con candidiasis sistémica y/o superficial. Estas observaciones sugieren que la especie CaHpbp podría tener un papel como factor de virulencia en este hongo. __________________________________________________________________________________________________