Clonación y secuenciación del gen egl 1 de "Trichoderma longibrachiatum" y su expresión en una levadura vínica industrial

Résumé

SE HA CLONADO, MEDIANTE HIBRIDACION CON EL GEN HOMOLOGO DE TRICHODERMA REESEI, UN GEN DE HONGO FILAMENTOSO TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM QUE CODIFICA UNA B-1, 4-ENDOGLUCANASA. ESTE GEN, AL QUE SE HA DENOMINADO EG/1, PRESENTA UNA PAUTA ABIERTA DE LECTURA DE 1389 PB INTERRUMPIDA POR DOS INTRONES DE 123 Y 61 PB RESPECTIVAMENTE, Y CODIFICA UNA PROTEINA DE MASA MOLECULAR RELATIVA 48341. LA TRANSCRIPCION DEL GEN ES INDUCIDA POR UNA COMBINACION DE B-METIL GLUCOSIDO Y LACTOSA, DANDO LUGAR A UN MRNA DE APROXIMADAMENTE 1.8 KB. ESTE MENSAJERO ES DETECTABLE SOLO DURANTE UNAS 8 HORAS EN CULTIVOS DE REEPLAZAMIENTO. LA ADICION DE UN 1% DE GLUCOSA AL MEDIO DE INDUCCION REPRIME LA TRANSCRIPCION DEL GEN. MEDIANTE CONTRANSFORMACION SE HAN OBTENIDO TRANSFORMANTES CON MULTIPLES COPIAS O CON UNA COPIA ECTOPICA DEL GEN EG/1. ALGUNOS DE ELLOS PRODUCEN DOCE VECES MAS ACTIVIDAD CM CASA QUE LA CEPA RECEPTORA. NO SE APRECIA NINGUNA CORRELACION ENTRE EL NUMERO DE COPIAS DEL GEN EG/1 INCORPORADO POR DIFERENTES TRANSFORMANTES Y EL INCREMENTO EN LA ACTIVIDAD CM CASA. EL SITIO DE DE INTEGRACION DEL PLASMIDO TRANSCRIPCION Y PARA EL AUMENTO DE LA SECRECION DE LA PROTEINA. SE HA DESARROLLADO UN SISTEMA DE TRANSFORMACION PARA LA LEVADURA VINICA INDUSTRIAL T73 BASADO EN EL EMPLEO DE LA RESISTENCIA A CICLOHEXIMIDA COMO MARCADOR DE SELECCION. ESTE SISTEMA SE HA UTILIZADO PARA EXPRESAR EL CDNA DEL GEN EG/1 EN LA CEPA T73. EN EXPERIMENTOS DE MICROVINIFICACION CON ESTA LEVADURA RECOMBINANTE SE HA DETECTADO LA SECRECION DE LA PROTEINA EGI ACTIVA AL MOSTO. LOS MOSTOS FERMENTADOS POR ESTA LEVADURA RECOMBINANTE PRESENTAN UN INCREMENTO EN EL AROMA AFRUTADO, UN CARACTER APRECIADO EN ENOLOGIA. EL ANALISIS DE ESTOS MOSTOS PERMITE DETECTAR UN INCREMENTO EN LA CONCENTRACION DE VARIOS COMPUESTOS VOLATILES RELACIONADOS CON EL AROMA.