Clonaje y caracterización de una ent-copalill difosfato sintasa de citrange carrizo y efecto de su sobreexpresión en plantas de tabaco

Résumé

Las giberelinas (GAs) son hormonas que intervienen en numerosos aspectos del desarrollo vegetal, incluyendo la elongación del tallo. El primer caso en la ruta de biosíntesis de GAs es la conversión del geranilgeranil difosfato (GGPP) a ent-kaureno, vía copalil difosfato (CPP). Estas dos reacciones están catalizadas por las ciclasas ent-copalil difosfato sintasa (CPS) y ent-kaureno sintasa (KS), respectivamente. En este trabajo se ha aislado un clon de cDNA, CcPS1, que codifica una CPS del híbrido citrange Carrizo (Citrus sintesis (L.) Obs x Poncirus trifoliata (L.) Raf, ampliamente utilizado como patrón en cítricos) y se ha evaluado el efecto de su sobreexpresión sobre el fenotipo de plantas transgénicas de tabaco. También se ha obtenido un clon parcial de un gen, CcPS2, que posiblemente codifica una segunda CPS en citrange Carrizo. Se ha desmostrado que CcCPS1 procede del parental Poncirus trifoliata, mientras que CcCPS2 procede de Citrus sinensis, el otro parental de citrange Carrizo. Se ha obtenido la secuencia de DNA genómico correspondiente a la región codificante del gen CcCPS1 y se ha encontrado que este gen codifica tras proteínas diferentes, denominadas CcCPS1a, CcCPS1b, CcCPSc, como consecuencia de un mecanismo de corte-empalme alternativo en el proceso de maduración del pre-RNAm. Sin embargo, únicamente los productos de expresión en E.coli del clon CcCPS1b son capaces de metabolizar GGPP a CPP in vitro. CcCPS1 se expresa en muy bajos niveles y su expresión está limitada a órganos vegetativos y reproductivos en crecimiento activo. La expresión de CcCPS1 se induce a corto plazo por un aumento en la temperatura, y también mediante la aplicación de inhibidores de la ruta de biosíntesis de GAs. Plantas transgénicas homocigotas de Nicotiana tabacum que sobreexpresan el clon CcCPS1b de citrange Carrizo eran más altas (entre9-12%) y tenían un fenotipo de inflorescencias y entrenudos y pedúnculos florales má