Agregación nuclear de la pabpn1 en neuronas oxitocinérgicas normales y en miocitos de la distrofia muscular oculofaríngea

Resumen

La proteína de unión a la cola de Poli(A)-PABPN1- es ubicua en el núcleo y en el citoplasma de todas las células somáticas. Es muy abundante en el núcleo donde se distribuye difusamente por el nucleoplasma, se concentra en los dominios nucleares denominados -speckles- y no se detecta en el nucleolo. En el núcleo, PABPN1 forma homopolímeros que pueden permanecer unidos a las colas de los RNAs poliadenilados formando complejos PABPN1/Poli (A) (Wahle, 1991). Los RNAs poliadenilados incluyen la mayoría de RNAs mensajeros (mRNAs) y una fracción muy amplia de RNAs no codificantes de proteínas (Lemay y cols., 2010). PABPN1 tiene un peso molecular previsto de 32,8 kDa y en su forma nativa, es una proteína de 306 aminoácidos con varios dominios. El extremo N-terminal, hidrofóbico-ácido, comprende (i) un tramo de 10 alaninas consecutivas (A-rich domain), codificadas por un microsatélite de 6 codones (GCG)6 y una corta secuencia de (GCA)3 y de (GCG)1 que codifican el resto de alaninas, (ii) una región rica en prolinas (Pro) y (iii) un dominio de unión al factor transcripcional específico de las células musculares denominado SKIP. Los residuos situados entre los aminoácidos 116 y el 151 forman una estructura en ¿-hélice -Coiled-coil domain-,necesaria para estimular a la Poli (A) polimerasa. La región central incluye el dominio de unión a RNAs (dominio RRM). Finalmente, el extremo C-terminal básico, es un dominio rico en argininas dimetiladas asimétricamente (R-rich domain) e incluye la secuencia de localización nuclear (NLS) y el dominio de unión a la Poli (A) polimerasa. A estos dominios hay que añadir dos secuencias de homo-oligomerización de la proteína PABPN1 comprendidos entre los aminoácidos 155 a 306. Este macrodominio le confiere a la proteína la capacidad de homo-oligomerizar incluso en ausencia de mRNAs (Fan y cols., 2001). Desde un punto de vista funcional, PABPN1 es una proteína multifuncional, que controla, a diferentes niveles, la expresión génica y la maduración de transcritos poliadenilados (Bag y Bhattacherjee, 2010). Así, a nivel co-transcripcional, destaca su capacidad inductora de la enzima poli (A) polimerasa (PAP) (Kühn y Wahle, 2004) y, a nivel post-transcripcional, su unión a la cola de poli (A) de los mRNA, que es un requisito imprescindible para la exportación, estabilidad y traducción del transcrito en el citoplasma (Cheadle y cols., 2005). El descubrimiento de que la mutación, por expansiones de tripletes que codifican alaninas, en el gen PABPN1 humano es la causa etiopatológica de la distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) ha permitido relacionar a esta proteína con la familia de síndromes neuromusculares hereditarios causados por la expansión en unidades de códones (GCN)n en las TNRs (Brais y cols., 1998). En el caso de la OPMD, el producto génico es la PABPN1 expandida en alaninas (PABPN1exp-Alan-OPMD), una mutación que hace a la proteína muy proclive a la homo-oligomerización nuclear en cuerpos de inclusión específicos de las FMEE. Además, los polímeros de PABPN1exp-Alan-OPMD en las inclusiones intranucleares, se acompaña de RNAs poliadenilados y de componentes de la vía ubiquitina-proteasoma (VUP) (Tome y Fardeau, 1980; Calado y cols., 2000a; AbuBaker y Rouleau, 2007). El significado patogénico de las IINs-PABPN1exp-Alan en el núcleo de las fibras musculares en la enfermedad OPMD sigue siendo objeto de debate en la actualidad. Para algunos autores, la forma difusa de la proteína expandida es tóxica y produce muerte celular. Por ello, la agregación de la PABPN1exp-Alan en cuerpos de inclusión podría jugar un papel protector para la célula muscular (Messaed y cols., 2007). Por otra parte, en un estudio de nuestro laboratorio se ha demostrado que en condiciones fisiológicas la proteína PABPN1 nativa forma de modo natural inclusiones intranucleares en las neuronas oxitocinérgicas del núcleo supraóptico de la rata (IIN-PABPN1-SON). Esta IIN-PABPN1 es única en el núcleo neuronal, adopta forma de bastoncillo y su estructura y organización molecular es muy parecida a las inclusiones que forma la PABPN1 expandida en la OPMD. Como en la OPMD, la IIN-PABPN1-SON concentra polímeros de PABPN1, RNAs poliadenilados, conjugados de ubiquitina-proteína y proteasoma. Sin embargo, una diferencia fundamental es que en nuestro modelo animal la proteína PABPN1 silvestre se agrega en condiciones fisiológicas, indicando que las expansiones de polialaninas son prescindibles para la homo-oligomerización nuclear de la PABPN1 (Berciano y cols., 2004). RESUMEN Este trabajo de investigación se ha dividido en dos bloques claramente diferenciados; en el primero de estos bloques, hemos querido profundizar en el estudio de la organización y dinámica funcional de la PABPN1 silvestre tanto en disociados de neuronas del SON como en líneas celulares cultivadas. En particular nos centramos en tres objetivos: (i) definir si la IIN-PABPN1-SON constituye un compartimento nuclear específico, (ii) abordar la dinámica funcional de la PABPN1 endógena en tres modelos biológicos: el desarrollo postnatal, la respuesta al estrés osmótico y la respuesta a la inhibición del proteasoma, y (iii) sobre la base de que la IIN-PAPBN1-SON representa un compartimento enriquecido en RNAs poliadenilados (Berciano y cols., 2004), identificar la naturaleza de los putativos RNAs concentrados en la IIN-PABPN1-SON. Con respecto al segundo bloque, nos propusimos investigar las causas que determinan la predisposición a la agregación de las proteínas PABPN1 silvestre y mutada y profundizar en la importancia de su agregación en la fisiopatología de la enfermedad. Utilizando muestras de tejido muscular de pacientes con OPMD, líneas celulares cultivadas, incluyendo cultivos primarios de mioblastos humanos y modelos bioinformáticos de simulación de la expansión de la proteína PABPN1 patológica, desarrollamos los siguientes objetivos: (i) establecer la relación entre el grado de distrofia muscular y el tiempo de evolución de la enfermedad, (ii) estimar la cinética de agregación de la proteína PABPN1 expandida respecto a la silvestre, (iii) definir el dominio de la proteína que determina la agregación, (iv) conocer la repercusión estructural y funcional que la expansión del dominio N-terminal produce en péptidos sintéticos, (v) determinar si el incremento de la hidrofobicidad producida por la expansión en alaninas modifica las interacciones moleculares con otras proteínas y, (vi) conocer si la proteína PABPN1 expandida experimenta modificaciones postraduccionales, incluyendo la metilación, chaperonización, ubiquitilación-proteólisis y SUMOilación. Los resultados de la primera parte nos permiten proponer el siguiente modelo funcional de la IIN-PABPN1 de las neuronas del SON: la proteína PABPN1 nativa tiene capacidad de homo-oligomerizar en una inclusión única con identidad propia, que está enriquecida en RNAs poliadenilados no identificados. Carece de DNA pero está rodeada de eucromatina, donde se localizan genes activos y transcritos primarios. En esta localización, la IIN-PABPN1 puede operar en el reclutamiento de mRNAs poliadenilados redundantes, aberrantes o no aptos para su exportación y/o su degradación. En este sentido, se ha demostrado que sólo son exportados al citoplasma aquellos mRNAs de la oxitocina con colas poliadeniladas de larga longitud (Burbach y cols., 2001). La íntima y específica asociación espacial entre la IIN-PABPN1-SON y -speckles-nucleares de factores de -splicing-, CBs y clastosomas plantea la existencia de una relación dinámica entre estas organelas nucleares con posibles implicaciones en el procesamiento co-transcripcional de mRNAs poliadenilados y, en el caso de la asociación IIN-PABPN1-clastosoma, en la proteóstasis nuclear degradando proteínas mal formadas, redundantes o innecesarias de la IIN-PABPN1. La dinámica de formación es inversamente proporcional a la actividad transcripciónal lo que sugiere un mecanismo de retención nuclear de poli (A) RNAs cuando disminuye su demanda citoplasmática. Con respecto a al segundo bloque de resultados, nuestro estudio pone de manifiesto 2 nuevos mecanismos que pueden contribuir a la patología de la OPMD. Mediante la interacción preferente con PABPN1exp-Alan, PRMT1 y Hsp70 son secuestradas en las inclusiones nucleares características de la enfermedad. Consecuentemente, se puede generar un déficit nucleoplasmático en la metilación y chaperonización de proteínas nucleares esenciales para la fisiología nuclear. De esta forma, se puede esperar que se den defectos en procesos nucleares como la maduración de algunos factores de -splicing- y poliadenilación que son dependientes de PRMT1, así como en el transporte de determinadas proteínas, su control de calidad y en la respuesta al estrés celular que son dependientes de Hsp70. Nuestros resultados predicen, además, que el tracto silvestre de alaninas de la PABPN1 está intrínsecamente desordenado y que es altamente flexible, mientras que la expansión de polialaninas en el péptido teórico N-terminal de PABPN1 induce la formación de un segmento en alfa hélice proporcional en tamaño al número de alaninas de la expansión. Este segmento ordenado en alfa hélice se localiza en el dominio de la proteína implicado en la interacción de la PABPN1 con otras proteínas. Interesantemente, datos de dinámica molecular mostraron en el péptido sintético 7ala N-terminal de la PABPN1 la presencia de una 5alfa hélice (¿-hélice) que presenta mayor entropía que una alfa hélice común. La presencia de este segmento en hélice en las variantes de PABPN1exp-Alan podría modular sus interacciones y modificar la especificidad y afinidad por sus dianas moleculares. Aunque se ha propuesto como causa de la OPMD la tendencia a la agregación por parte de la proteína PABPN1 expandida, hay que destacar que esta capacidad inherente a la agregación no es exclusiva de la proteína mutada sino que también se observa en la proteína silvestre. Basado en evidencias descritas en este trabajo, proponemos que las expansiones en el tracto de alaninas alteran la conformación de la proteína PABPN1 y además cambian sus propiedades de interacción con otras proteínas independientemente de la formación de inclusiones nucleares, representando un mecanismo adicional que contribuye a la patogenia de la enfermedad. Consideramos que la proteotoxicidad de la PABPN1 expandida está causaba por una red de interacciones proteicas alterada, lo que tiene importantes implicaciones para el desarrollo de nuevas estrategias terapeúticas como son los modificadores de funciones alteradas de las proteínas a través de fármacos.