Ras site-specific effects in thyroid cancermemoria

Resumen

1. INTRODUCCIÓN: RAS, es uno de los oncogenes más mutados en cáncer. Hoy en día sabemos que las proteínas RAS de la membrana plasmática están presentes en diferentes microdominios, como en las balsas lipídicas (BL) o en membrana desordenada (MD), y su distribución está modulada por la depalmitoilasa, APT-1. Además, RAS también se localiza en diferentes organelos intracelulares siendo los más comunes el Retículo Endoplasmático (RE) y el Complejo de Golgi (CG) donde también es funcional, contrastando con una idea inicial de una sola fuente de las señales de RAS. Sin embargo, poco se ha sabe de cómo la sublocalización de RAS afectan a su potencial oncogénico. Es bien conocido que las mutaciones de RAS están presentes en distintos tipos de cánceres humanos y el cáncer de tiroides es uno de ellos. De hecho, los carcinomas papilares de tiroides presentan un 26% de mutaciones en RAS, los carcinomas foliculares de tiroides sobre un 40% y los carcinomas anaplásicos, los más agresivos, sobre un 53%. Sin embargo, las mutaciones de RAS también ocurren en un 20-25% de los adenomas benignos tiroideos. En consecuencia, a pesar de que en la última década se ha realizado un esfuerzo considerable en asociar la presencia de RAS con el manejo clínico de los nódulos tiroideos y del cáncer de tiroides. Sin embargo, la gran mayoría de los nódulos tiroideos positivos para RAS son clasificados como indeterminados. Además, debido al papel incierto de RAS en la evolución clínica del cáncer de tiroides, ha sido difícil usar las mutaciones de RAS para ayudar al manejo de estos tumores. En consecuencia, nuevos conceptos son necesarios para descartar la malignidad y predecir la agresividad en los cánceres de tiroides ya que las nuevas guías clínicas se están encaminando a aproximaciones más conservadoras. Además, en los últimos años ha surgido una nueva faceta de RAS en cáncer, ya que se ha visto que RAS tiene un papel importante en la biogénesis, mantenimiento, secreción y modificación del contenido de los exosomas. Los exosomas son vesículas extracelulares que tienen diferentes tipos de contenido, incluyendo proteínas, mRNA, miRNA, DNA y nlRNA. Estas vesículas afectan fundamentalmente la evolución de diferentes tipos de cáncer como melanoma y colorectal entre otros afectando al crecimiento tumoral, a la angiogénesis, la invasión y la metástasis. Por tanto, hipotetizamos que el cambiante comportamiento de RAS en el cáncer de tiroides es debido a los efectos diferenciales de RAS en función de su diferente localización en la célula. 2. OBJETIVOS: -Estudiar cómo RAS en sus diferentes sublocalizaciones contribuye al cáncer de tiroides -Encontrar nuevos marcadores para descartar malignidad en los nódulos de tiroides mutados en RAS y determinar agresividad en cáncer de tiroides. - Elucidar la relevancia de los exosomas en la carcinogénesis de tiroides mediada por RAS en sus diferentes sublocalizaciones. 3. MATERIALES Y MÉTODOS: Para explorar el papel de las sublocalizaciones de RAS en el cáncer de tiroides elegimos las células PCCL3 que no tienen mutaciones conocidas, y las transfectamos con vectores de pCEFL hemaglutinina (HA) que contienen las señales diana M1, LCK, CD8α y KDELr unidas a H-, N- o K-RASv12. Éstas señales dirigen a RAS a retículo endoplásmico, balsas lipídicas, membrana desordenada y aparato de Golgi, respectivamente. Además, usamos el modelo de metástasis espontanea del embrión de pollo para analizar los efectos de estas células en el crecimiento tumoral y metástasis y determinar los efectos de diferentes proteínas. Los exosomas fueron aislado por cromatografía de exclusión por tamaño y sus efectos fueron probados in vitro y en el modelo de pollo. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Para analizar los efectos de las sublocalizaciones de RAS en el cáncer de tiroides utilizamos las células PCCL3 expresando H- o N-RASv12 en retículo endoplasmático (RE), balsas lipídicas (BL), membrana desordenada (MD) y complejo de Golgi (CG). Para K-RASv12 RE y MD. Cuando analizamos sus efectos in vitro observamos que no había diferencias entre las sublocalizaciones de RAS en la proliferación, pero sí en la migración, induciéndola RAS en MD y GC. Además, RAS era capaz de inducir apoptosis desde todas las localizaciones celulares excepto desde BL y más notablemente desde CG, lo que puede estar relacionado por los efectos de RAS en la inestabilidad genómica y su posible inducción de una catástrofe mitótica. Al mirar el papel de RAS in vivo en el modelo de metástasis del embrión de pollo, vimos que los tumores más pequeños, generados por RAS en MD y CG, eran los más metastáticos. Además, para confirmar que esto también sucedía en líneas celulares con H-RAS endógeno mutado analizamos la locación de RAS en BL y MD, los cuales exhibieron efectos opuestos, en las células tumorales de cáncer anaplásico de tiroides C643 y HTH83. Fuimos capaces de ver que las células C643 tenían H-RAS en BL y las células HTH83 células en el modelo de pollo pudimos observar que las células HTH83, con H-RAS mutado,esta vez endógeno, en MD, generó tumores más pequeños con mayor potencial metastático en comparación con las células C643. Además, la alteración de APT-1 fue capaz de promover la translocación de H-RAS, modificando los efectos en crecimiento tumoral y metástasis de las dos líneas celulares. Al ver que los niveles altos de APT-1 estaba relacionado con la localización de H-RAS en BL que exhibe mayores tumores, pero con poca capacidad de colonización a distancia, quisimos ver qué sucedía en tumores de pacientes. Para ello usamos la herramienta cBioPortal en la que seleccionamos una base de datos de mutaciones y alteraciones en niveles de mRNA y proteína de 507 pacientes con carcinomas papilares de tiroides. En este caso no encontramos ninguna co-ocurrencia entre las mutaciones de H-RAS y APT-1 aunque todos los pacientes con amplificaciones o ganancias de función en APT-1 un 100% de supervivencia. Esto sugiere que incluso la modulación de RAS wt por APT-1 podría estar ejerciendo un efecto en el proceso carcinogénico. Además, al analizar también alteraciones de APT-1 en melanoma, en el cuál si existían co-ocurrencias con mutaciones en H-RAS, observamos un aumento de supervivencia de casi un año en esos casos con altos niveles de APT-1 mientras que al mirar los efectos de su deleción o perdida de expresión observamos lo contrario. Por tanto, esto sugiere que APT-1 puede ser un buen marcador pronóstico en cáncer de tiroides y melanoma. Al observar inmunohistologicamente los tumores generados por RAS en sus diferentes sublocalizaciones observamos que RAS en RE y BL, las localizaciones en las que RAS generaba los tumores más grandes, pero con menos capacidad de metastatizar, parecían presentar gotas lipídicas, lo cual confirmamos usando una tinción de red oil. Además, fuimos capaces de relacionar el acúmulo de lípidos con los niveles de VEGF-B, un miembro de la familia de VEGF con poca capacidad angiogénica. Cuando añadimos VEGF-B a los tumores formados por las otras sublocalizaciones de RAS, MD y CG, observamos que esta proteína era capaz de aumentar el tamaño tumoral y disminuir la metástasis. Por tanto, VEGF-B al estar presente a altos niveles en los tumores menos metastáticos podría ser un posible marcador de invasividad en tumores de tiroides. En cuanto a los efectos de las sublocalizaciones de RAS en la biogénesis, secreción y cargo de los exosomas, fuimos capaces de determinar que las sublocalizaciones de RAS pueden modular diferencialmente el tamaño, la cantidad y el cargo de los exosomas. Sorprendentemente hemos demostrado que los exosomas secretados por células con RAS en MD y CG son capaces de transferir su potencial metastático a otras células lo que sugiere que podrían estar modulando la intravasación, la supervivencia celular en el torrente sanguíneo y/o el nicho pre-metastático. 5. CONCLUSIONES: En resumen, hemos encontrado que el tamaño de los tumores generados por H-RAS y NRAS en sus diferentes sublocalizaciones no se correlaciona con su potencial metastático. Además, hemos visto que la modificación de los niveles de APT-1 afecta la proliferación y el potencial metastático de los tumores de tiroides al regular la presencia de RAS en los diferentes microdominios de la membrana plasmática. Por otro lado, los tumores formados por H-RAS en RE y BL presentan gotas lipídicas cuya acumulación se relaciona con los niveles de VEGF-B el cuál es capaz de aumentar el tamaño tumoral, pero disminuir la metástasis. Debido a ello, tanto APT-1 como VEGF-B podrían ser propuesto como posibles marcadores a estudiar para determinar la posibilidad de colonización a distancia. Además, los exosomas secretados por células expresando H-RASv12 en sus diferentes localizaciones celulares son diferentes en tamaño, se secretan en diferente cantidad, presentan diferentes marcadores y presentan efectos diferenciales en proceso carcinogénico.