Análisis farmacogenómico de la acción de fármacos antineoplásicos. Identificación de aqp3 y tigar como nuevas dianas

Resumen

La investigación oncológica ha avanzado mucho en los últimos años, sin embargo la resistencia a la quimioterapia continua siendo uno de los mayores problemas. Por este motivo, es necesario estudiar en profundidad los procesos implicados en la acción citotóxica de los fármacos, con el fin de que el tratamiento sea lo más efectivo posible. Para ello, son de gran utilidad los estudios farmacogenómicos, que permiten la evaluación de una gran cantidad de genes al mismo tiempo. Sin embargo, se requiere un estudio más detallado de cada uno de los genes que se encuentren para poder entender su implicación en la respuesta celular o en la resistencia a un fármaco concreto. Con este objetivo, se realizó un estudio farmacogenómico en pacientes de leucemia linfática crónica (LLC) resistentes y sensibles al tratamiento con fludarabina. La validación en 27 pacientes de los genes obtenidos como diferencialmente expresados entre pacientes sensibles y resistentes a la fludarabina, dio como resultado que la SERPINA B9 y la SERPINA E2 se encontraban sobreexpresadas en los pacientes más sensibles respecto a los más resistentes. Por otro lado, la idea de que no sea un solo gen sino un conjunto de genes el que pueda predecir la respuesta a un tratamiento quimioterapéutico determinado es cada día más fuerte. En este sentido, se decidió realizar el análisis del perfil de expresión de un conjunto de genes que codifican para proteínas transportadoras o canales de membrana, con el fin de definir el transportoma o grupo de genes relacionados con el transporte de fármacos capaz de predecir la respuesta a un tratamiento antineoplásico. Se analizó la expresión de 27 genes en 10 pacientes de leucemia linfática crónica. Se hallaron correlaciones estadísticamente significativas entre la expresión de algunos genes de la familia ABC y los marcadores de predicción CD38 y ZAP70 o la respuesta ex vivo al tratamiento. Los microarrays también pueden ayudar de forma muy notoria a encontrar nuevas dianas del tratamiento antitumoral. En este sentido, un estudio farmacogenómico previo realizado en nuestro laboratorio identificó la acuaporina 3 (AQP3) como una nueva diana del tratamiento con 5'-DFUR en la línea celular derivada de adenocarcinoma mamario MCF7. Por ello nos planteamos estudiar la implicación de la AQP3 sobre dicha respuesta. Observamos que el tratamiento con 5'-DFUR, 5-FU o gemcitabina inducen la expresión de AQP3 así como un aumento del volumen celular. Además, estos fármacos inducen un arresto de la célula en la fase G1/S, así como un aumento de los niveles de expresión de dianas como son FAS y p21. La inhibición de la expresión de AQP3 mediante un siRNA específico bloquea parcialmente el aumento de volumen inducido por los fármacos y también revierte parcialmente el arresto del ciclo celular así como la inducción de las dianas FAS y p21. Al mismo tiempo, es destacable el hecho de que la inhibición de AQP3 revierte la citotoxicidad inducida por el tratamiento con los fármacos. Además, utilizando dosis altas de 5-FU para inducir la apoptosis celular, no observamos la inducción de AQP3 que se da con el tratamiento a dosis bajas de 5-FU, condiciones bajo las que se induce la parada del ciclo celular. Los resultados expuestos sugieren que la induccion de la AQP3 tras el tratamiento con fármacos genotóxicos está implicada en la respuesta celular a estos fármacos y que AQP3 ejercería un papel a nivel de parada del ciclo celular y no cuando la célula es conducida a apoptosis. Por otro lado, decidimos realizar experimentos de microarrays de DNA en células de pacientes de LLC con un objetivo similar al del estudio en el que se identificó la AQP3. Tras la validación de 20 de los genes encontrados en el array de alta densidad en un grupo de 27 pacientes escogidos en un rango amplio de sensibilidad a fludarabina, se obtuvieron 17 genes inducidos tras 24 horas de tratamiento con fludarabina. Los niveles de inducción de la mayoría de ellos correlacionaban, además, con la citotoxicidad ex vivo a la fludarabina. Cada vez existe un mayor número de evidencias que apoyan la idea de que la internalización del fármaco por una u otra de las isoformas de los transportadores de nucleósidos puede repercutir sobre la acción citotóxica del mismo. En este trabajo se ha encontrado que en LLC es hENT2 la isoforma más importante en la respuesta transcriptómica de la fludarabina y en su acción citotóxica. Estas evidencias apoyan los resultados previos obtenidos en nuestro grupo de investigación (Molina-Arcas et al., 2005). El estudio farmacogenómico realizado en pacientes de LLC también nos permitió la identificación de varias dianas del tratamiento con fludarabina, entre ellas, se halló sobreexpresado el gen TIGAR. Estas evidencias junto con los antecedentes existentes que describen TIGAR como un gen regulado por p53 e implicado en apoptosis (Bensaad et al., 2006), nos condujeron a profundizar en su estudio. Se analizaron dos líneas celulares derivadas de cáncer de mama y dos derivadas de cáncer de páncreas, y se estudió el efecto de 8 fármacos antineoplásicos de diferente naturaleza. Los resultados muestran una inducción del mRNA de TIGAR dependiente del tiempo en las líneas celulares de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB-231 en respuesta a la mayoría de fármacos, aunque esta inducción es mucho mayor para la línea celular MCF7 que presenta p53 funcional. En cambio, las líneas celulares derivadas de cáncer de páncreas tienen unos niveles de inducción mucho más bajos que las de mama. Se halló una correlación estadísticamente significativa entre la inducción de los niveles de ROS y la apoptosis celular inducida por los diferentes fármacos en ambas líneas de cáncer de mama. Sin embargo, a pesar de la correlación entre la inducción de los niveles de ROS y la apoptosis, no se encontró ninguna relación entre la inducción de TIGAR y estos dos parámetros en ninguna de las dos líneas analizadas. Con el fin de estudiar la implicación de TIGAR sobre la respuesta celular, se utilizó un siRNA específico de TIGAR para inhibir su expresión. La inhibición de TIGAR provoca un aumento en la producción de ROS inducida por el tratamiento con los fármacos genotóxicos. Por otro lado, la inhibición de TIGAR revierte parcial pero significativamente la citotoxicidad inducida por 5'-DFUR, 5-FU y gemcitabina, fármacos que inducen la expresión de TIGAR, no ocurriendo lo mismo con el bortezomib que induce la expresión de TIGAR en mucha menor medida.