Mejora en la tolerancia a la sequía de plantas con interés biotecnológico en zonas de secano

Resumen

En la presente tesis doctoral hemos estudiado la mejora a la tolerancia a la sequía de plantas con interés agrícola mediante herramientas biotecnológicas. A lo largo del presente trabajo se comprobó el efecto de una colección de bacterias xerotolerantes sobre plantas como inoculantes, para estudiar si existe una correlación entre el nivel de tolerancia a la falta de agua del microorganismo, con el nivel de protección frente a la sequía que transfiere el microorganismo a la planta. Para este estudio se analizó la capacidad de promover el crecimiento de las plantas por parte de los microorganismos en ausencia de estrés hídrico (su actividad como Bacterias Promotoras del Crecimiento de Plantas o BPCP), así como de protección de las mismas frente a la sequía (Bacterias Potenciadoras de la Tolerancia a Sequía o BPTS). Para este estudio se emplearon las cepas microbianas Microbacterium sp. 3J1, Arthrobacter koreensis 5J12A, Rhodococcus sp. 4J2A2, Leucobacter sp. 4J7B1 y Arthrobacter siccitolerans 4J27, por presentar una elevada supervivencia a la desecación de más del 20%. Para evaluar los efectos de promoción del crecimiento de plantas y de protección de estas plantas contra la sequía sobre distintas especies vegetales se emplearon plantas de pimiento (Capsicum annuum var. annuum), tomate (Solamun lycopersicum), maíz (Zea mais) y soja (Glycine max). Así mismo, se identificaron las cepas taxonómicamente más cercanas a aquellas que mayor protección contra la sequía sobre las plantas generaban y se estudió de nuevo si existía una correlación entre aquellas cepas más tolerantes a la sequía con aquellas que más protegían a las plantas contra la falta de agua. Por último, se realizó un estudio bioquímico del perfil de moléculas implicadas en procesos de fitoprotección frente a la sequía por parte de microorganismos (trehalosa, actividades superóxido dismutasa y catalasa, ácido indolacético, ácido abscísico y otras fitohormonas) para identificar si existe una correlación entre la producción de las mismas y los efectos observados en las plantas. Posteriormente se estudiaron los mecanismos moleculares por los que las plantas inoculadas con Microbacterium sp. 3J1 alcanzaron un elevado grado de promoción en su crecimiento y resistencia frente a la sequía. Este estudio se realizó mediante análisis proteómico y metabolómico. De entre las cuatro especies vegetales estudiadas en el capítulo anterior, seleccionamos la planta de pimiento como modelo tanto por contar con amplia difusión en la literatura científica en proteómica y metabolómica, como por contar con su genoma completamente secuenciado y accesible. Los estudios de proteómica se llevaron a cabo mediante ensayos basados en geles bidimensionales (SDS-PAGE 2D), mientras que los estudios de metabolómica se realizaron mediante cromatografía de gases masas (GC-MS). Gracias a ambos tipos de estudios se pudo caracterizar las rutas involucradas en la resistencia a la sequía. Tanto los estudios de proteómica como los de metabolómica se realizaron sobre plantas de pimiento, en condiciones de sequía, y en presencia del microorganismo Microbacterium sp. 3J1. En estas condiciones se utilizaron cultivos adicionados de polietilen glicol (PEG) al 5% y al 50% para simular condiciones de escasez de agua propias de un suelo no encharcado y de una sequía intensa, respectivamente. Más adelante, se analizó el grado de bioseguridad de las cepas xerotolerantes estudiadas, ya que cualquier producto microbiológico que se libere al medio ambiente debe ser inocuo y seguro tanto para el ser humano como para el medio ambiente. Dada la diversidad de pruebas propuestas y la falta de un marco regulador que indique los análisis necesarios para garantizar la inocuidad de microorganismos que han de usarse como agente inoculante sobre plantas, se planteó combinar una serie de ensayos basados en modelos de organismos presentes en el medio ambiente que pudieran verse potencialmente afectados, así como de modelos de infección para el ser humano. La combinación de ensayos de bioseguridad con organismos tales como Caenorhabditis elegans, Eisenia foetida, Mus musculus o Daphia magna, sirvieron de modelo para reconocer posibles interferencias a cualquier nivel trófico del suelo, incluido el humano, que pudiera causar el uso de las cepas en estudio en el caso de librearse al medio ambiente. Como resultado final establecimos un valor numérico indicativo del nivel de seguridad de las cepas que se denominó Índice de Seguridad Humana y Ambiental (ISHA). Como controles para los distintos ensayos descritas como bacterias promotoras del crecimiento en plantas se emplearon así mismo las cepas Pseudomonas putida KT2440, Burkholderia cepacia CC-A174, Serratia marcescens CTC 10211, Serratia entomophila CIP 102919, Serratia proteamaculans NCTN 394 y Pseudomonas aeruginosa PA14. Además de estas cepas se incluyó una colección de cepas descritas como promotoras del crecimiento de plantas tales como Pseudomonas fluorescens IABPF05, Azotobacter vinelandii IABAV02, Rhizobium legominosarum IABRL05 y Bacillus subtilis IABBS05. Tras comprobar que las cepas estudiadas mostraron unos niveles de bioseguridad altos, se decidió llevar a cabo ensayos de invernadero y campo. Como planta modelo, se empleó el maíz (Zea mays) al tratarse de una de las especies ensayada con mejores resultados, así como una de las plantas con mayor implicación en sectores agrícolas, por su interés tanto alimenticio como bioenergético. En estos ensayos en invernadero así como en los ensayos de campo se emplearon las cepas xerotolerantes con mejores resultados en laboratorio (Microbacterium sp. 3J1 y A. koreensis 5J12A, empleando cápsulas plásticas sobre semillas como formato de inoculación, tanto para los ensayos de invernadero como para la siembra en campo. Los resultados de promoción del crecimiento y protección frente a la sequía en plantas por parte de las cepas xerotolerantes obtenidos en laboratorio (en condiciones ambientales controladas) no coincidieron con los obtenidos en invernadero y campo (donde el control ambiental está más limitado). Para la mejora de los resultados en condiciones ambientales poco controladas se buscó una formulación alternativa a la formulación líquida, donde la conservación del número de células viables en el tiempo, la contaminación y el almacenamiento del producto resultan en peores resultados. Para identificar qué formulación alternativa se adaptaba mejor al microorganismo Microbacterium sp. 3J1, se estudió los mecanismos de interacción y colonización del microorganismo sobre la planta. Además, para identificar el microorganismo en su interacción con la planta y el tipo de relación que mantenían se marcó a las bacterias con proteína verde fluorescente. Con este marcaje pudimos determinar el tiempo mínimo de presencia del inoculante en el suelo, las condiciones en que se lleva a cabo dicho contacto y los tiempos empleados en las distintas fases de colonización e interacción con la planta. Como alternativa de inoculación se empleó alginato, y se estudió la calidad del inoculante mediante el análisis del número de células viables en el tiempo. Along this thesis we studied the improvement to the drought tolerance of plants with agricultural interest using biotechnological tools based on several bacterial strains. Our studies were based on a collection of bacteria isolated as drought tolerant as all of them had been isolated employing a selective method developed in our lab. This method consist in alter growth conditions of isolates (obtained from roots and closer soil) by applying chloroform in contact as desiccant selective agent. Throughout this work the effect of these strains as growth promoters and as drought protectors over plants as inoculants were found. We studied whether there is a correlation between the levels of tolerance in the strains, and the levels of protection against drought transferred by the microorganism to the plant. For this study, the ability to promote the growth of plants by microorganisms in the absence of water stress (his activity as growth-promoting bacteria or PGPR), as well as protecting them against drought was analyzed. For this study the microbial strains Microbacterium sp. 3J1, Arthrobacter koreensis 5J12A, Rhodococcus sp. 4J2A2, Leucobacter sp. 4J7B1 and Arthrobacter siccitolerans 4J27 were used, since they present a high survival desiccation of over 20%. To evaluate the effects of plant growth promotion and protection of these plants against drought different plant species like pepper plants (Capsicum annuum var. annuum), tomato (Solamun lycopersicum), corn (Zea mais) and soybeans (Glycine max), clover (Trifolium repens), etc., were employed. Likewise, strains taxonomically closer to those greater protection against drought on plants generated were identified and studied again in order to discern if there was a correlation between those strains more tolerant to drought with those most protected the plants against lake of water. Finally, a biochemical profile study of molecules involved in processes of plant protection against drought by microorganisms (trehalose, catalase and superoxide dismutase activities, indole acetic acid, abscisic acid and other plant hormones) was performed to identify whether there is a correlation between the production thereof and the effects observed in plants. Trehalose shown to be the most determinant molecule to control physiological parameters in plants. Subsequently the molecular mechanisms by which plants inoculated with Microbacterium sp. 3J1 as it was the strain that reached a high degree of growth promotion and resistance to drought in plants. This study was performed using proteomic and metabolomic analysis. Of the plant species studied in the previous chapter, we selected the pepper plant as a model therefore have widely in the scientific literature in proteomics and metabolomics, as have its genome fully sequenced and accessible. Proteomic studies were performed by methods based on two-dimensional gels (2D SDS-PAGE) tests, while metabolomic studies were performed by gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). Both proteomic studies such as metabolomics were performed on pepper plants in drought conditions and in the presence of the microorganism Microbacterium sp. 3J1 and on Microbacterium sp. 3J1 separately. Under this last condition, strain cultures added with polyethylene glycol (PEG) of 5% and 50% to simulate stress conditions typical of a not waterlogged soil and intense dried soil, were carried out. With both types of studies could characterize the pathways involved in drought resistance. Later, the level of biosecurity on drought tolerant strains studied was analyzed, as any microbiological product release to the environment must be safe for both humans and the environment. Given the diversity of proposed evidence and the lack of a regulatory framework that indicates the analyzes necessary to ensure the safety of micro-organisms to be used as inoculant on plants, it was proposed to combine a series of organisms model-based trials that could potentially be affected, as well as models of infection for humans. The combination of biosafety tests with bodies such as Caenorhabditis elegans, Eisenia foetida, Mus musculus or Daphia magna, served as models for possible interference recognize any trophic level ground, including man, which could cause the use of the strains under study in the case of use massively in the environment. As a final result we established a numerical value indicative of the level of safety of the strains was called Environmental and Human Security Index (EHSI). After confirming that the strains studied showed high levels of biosafety, it was decided to undertake greenhouse and field trials. As a model plant, corn (Zea mays) was used to being one of the best performing species tested, as well as plants with greater involvement in agricultural sectors, both food and bioenergy interest. In these trials in greenhouse and field trials carried out with the drought tolerant strains with better results in the laboratory (Microbacterium sp. 3J1 and A. koreensis 5J12A) using plastic capsules as seed inoculation format for both the greenhouse tests were used as for planting in the field. The results of promoting growth and protection against drought in plants by the drought tolerant strains obtained in laboratory (under controlled conditions) did not coincide with those obtained in greenhouse and field (where environmental control is more limited). To improve results in poorly controlled environmental conditions sought an alternative to the liquid s capsuled-seed formulation, where the conservation of the number of viable cells over time, pollution and storage of the product formulation resulted in worse outcomes. To identify alternative formulation is better suited to the microorganism Microbacterium sp. 3J1, the mechanisms of interaction and colonization of the microorganism on the plant was studied by microscopy. The contact type, symbiosis modifications and the area where the strain is established in the root were detected by using VP-SEM and TEM. In addition, to identify the organism in its interaction with the plant and the type of relationship they had, it was labeled with green fluorescent protein (GFP) and by using laser confocal microscopy. With this label we could determine the minimum residence time of the inoculant on the ground, the conditions under which such contact takes place and the time spent on the various stages of colonization and interaction with the plant. All these techniques were confirmed by using qPCR and RT-PCR. Alternatively inoculation alginate was used, and the quality of inoculant was studied by analyzing the number of viable cells in time. We devolved a different formulation able to maintain stable the strains population in the inoculated substrate and, therefore, plant contact and interaction was notable extended. This time was extended from a pair of weeks in soil and close to a month in plants, to more than six weeks in soil and more than two month in plants. Finally, studies in transcriptomics and with negative mutant strains are being carried out in order to develop and consider better alternatives to improve routes involved and to achieve better formulations.